免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍，可以測定內分泌、蛋白質、細胞因子、細胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經遞質、肉瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質。根據診斷類別，又可分為傳染性疾病、內分泌、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑，封片。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察。免疫熒光技術具有高靈敏度和高特異性，可以檢測非常低濃度的目標分子。HAND1免疫熒光檢查

熒光物質，熒光色素：許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發射光波長520--530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質穩定，可長期保存。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結構式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。COX2免疫免疫熒光技術可以用于研究心血管系統的疾病和醫治。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織。對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定：取適當的固定劑固定樣本。一般用4%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結合。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光技術可以同時檢測多個目標分子，通過不同顏色的熒光染料進行標記。

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅。或者放于暗盒內，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據熒光抗體選擇合適的激發光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光是一種常用的生物學實驗技術，用于檢測和定位特定抗原或抗體。TNFa免疫組化IHC

使用熒光抗體方法是免疫熒光技術中常見的操作步驟。HAND1免疫熒光檢查

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。2.用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘。12.95%甘油封片。注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。HAND1免疫熒光檢查

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