免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細胞定位。r-H2AX免疫抗體

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。CY3免疫熒光早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術(shù)。

細胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片；抗原熱修復過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時間過長；染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號；建議設陰性對照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關疾病和自身免疫病。CY3免疫熒光

免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。r-H2AX免疫抗體

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。r-H2AX免疫抗體