插入突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估一些整合性載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、轉(zhuǎn)座子）可將外源基因插入整合到細(xì)胞基因組中，這可能會(huì)導(dǎo)致關(guān)鍵基因突變或jihuo原基因，從而導(dǎo)致惡性liu風(fēng)險(xiǎn)增加。影響插入突變的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素包括：（1）載體的整合特征，如插入位點(diǎn)的偏好性；（2）載體的設(shè)計(jì)，如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等構(gòu)建元件的活性，影響鄰近基因的潛力；產(chǎn)生剪接突變體的潛在剪接位點(diǎn)或多聚腺苷酸信號(hào)等；（3）細(xì)胞載體拷貝數(shù)；4）轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的功能活性（如與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)）和表達(dá)水平；5）靶細(xì)胞群的轉(zhuǎn)化可能性，這可能與細(xì)胞的分化狀態(tài)、增殖潛力、體外培養(yǎng)條件和體內(nèi)植入環(huán)境等有關(guān)。脫靶檢測(cè)簡(jiǎn)單有效的方法之一是全基因組測(cè)序法。浙江種子脫靶檢測(cè)CRO

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，它應(yīng)用CRISPR RNA（crRNA）以堿基互補(bǔ)的形式引導(dǎo)相應(yīng)的Cas蛋白識(shí)別入侵的外源基因組，并對(duì)其DNA進(jìn)行剪切，用以保護(hù)自身的基因組免受外源核酸如噬菌體、病毒等的干擾和破壞。經(jīng)過(guò)人為改造后，可在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性向?qū)NA(Single guide RNA, sgRNA)序列與靶序列進(jìn)行堿基配對(duì)，從而引導(dǎo)Cas蛋白結(jié)合到靶序列處，行使DNA切割功能，然后利用細(xì)胞的非同源性末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(Homologous recombination,HR)修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行插入缺失(Indel)、修復(fù)(Repair)或替換(Replacement)。由于其相對(duì)于鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄jihuo因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)技術(shù)更易于操作，而且更高效，因而被廣運(yùn)用于對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行靶向編輯。種子脫靶檢測(cè)服務(wù)脫靶檢測(cè)評(píng)估，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

目前鼓潤(rùn)已掌握了該項(xiàng)技術(shù)，簡(jiǎn)述如下：1、CRISPR與dsODNtag整合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及高通量測(cè)序建庫(kù)流程將靶向于目標(biāo)基因組位點(diǎn)的CRISPR質(zhì)粒與dsODNtag以核電轉(zhuǎn)的方式同時(shí)轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞，CRISPR造成基因組雙鏈斷裂后，dsODNtag將整合入斷點(diǎn)處，作為后續(xù)分析在靶與脫靶情況的標(biāo)記。轉(zhuǎn)染后3天收集細(xì)胞的DNA進(jìn)行高通量建庫(kù)。2、GUIDE-seq生信分析方法1）搭建了高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)分析流程。2）利用該技術(shù)分析了CRISPR靶向編輯某細(xì)胞系基因的在靶與脫靶情況。其中一例樣品的分析結(jié)果如圖4所示：Sequencesofoff-targetsitesidentifiedbyGUIDE-seq.Theintendedtargetsequenceisshowninthetoplinewithcleavedsitesshownunderneathandwithmismatchestotheon-targetsiteshownandhighlightedincolor.GUIDE-seqsequencingreadcountsareshowntotherightofeachsite.3）利用PCR擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合Sanger測(cè)序鑒定了分析出的脫靶位點(diǎn)。

當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品在生殖qiguan持續(xù)存在時(shí)，需要進(jìn)一步研究確定其在生殖細(xì)胞（例如卵母細(xì)胞、精子）的暴露水平。根據(jù)載體類型、復(fù)制能力、基因組整合特性、劑量水平、給藥途徑等因素，分析評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品生殖系整合風(fēng)險(xiǎn)。遺傳毒性，基因zhiliao產(chǎn)品將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)或整合到宿主基因組中或?qū)λ拗骰蚪M進(jìn)行編輯，存在潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)于判斷細(xì)胞基因組插入/修飾是否會(huì)產(chǎn)生遺傳毒性、是否較終會(huì)發(fā)生變依然還缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知，因此，需要分析基因組改變（載體或遺傳物質(zhì)整合進(jìn)基因組、對(duì)基因組編輯等）的特征，并評(píng)估相關(guān)潛在風(fēng)險(xiǎn)。挑選前面的潛在脫靶位點(diǎn)，通過(guò)PCR測(cè)序驗(yàn)證是否脫靶。

基因zhiliao產(chǎn)品特有的可能會(huì)引起遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產(chǎn)品可能會(huì)采用修飾宿主基因組的技術(shù)，并有可能在宿主細(xì)胞或組織中持續(xù)存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會(huì)指向基因組的特定位點(diǎn)，可能在整合位點(diǎn)處產(chǎn)生插入突變、或jihuo整合位點(diǎn)附近的原基因等，進(jìn)而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風(fēng)險(xiǎn)，例如，國(guó)外已有多項(xiàng)研究報(bào)告在接受了使用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因修飾細(xì)胞zhiliao的受試者中發(fā)生白血病。因此，對(duì)于存在此類風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)品，有必要進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪臨床研究以評(píng)估出現(xiàn)遲發(fā)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。脫靶檢測(cè)方法，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。杭州定量脫靶檢測(cè)CRO

如何降低脫靶效應(yīng)？選擇特異的gRNA； 使用RNP； 使用eSpCas9的質(zhì)粒； 使用Nickase Cas9。浙江種子脫靶檢測(cè)CRO

BLESS：利用生物素標(biāo)簽對(duì)DSBs進(jìn)行原位標(biāo)記，后經(jīng)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)于生物素標(biāo)記片段的富集，并通過(guò)二代測(cè)序?qū)崿F(xiàn)脫靶位點(diǎn)檢測(cè)。直接檢測(cè)細(xì)胞中的切割位點(diǎn)，靈敏度與細(xì)胞、組織密切相關(guān)。LAM-HTGTS，片段化的gDNA經(jīng)過(guò)LAM-PCR引入接頭，然后進(jìn)行全基因組易位測(cè)序。高通量的全基因組范圍檢測(cè)，可準(zhǔn)確檢測(cè)DSBs引發(fā)的重排。GUIDE-Seq，將dsODN    s標(biāo)簽整合到DSBs位點(diǎn)，通過(guò)二代測(cè)序檢測(cè)這些標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域，從而確定脫靶突變的位置。廣使用的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)方法。能檢測(cè)低頻脫靶突變。Digenome-Seq，片段化的gDNA與CRISPR/RNP混合孵育，進(jìn)行全基因組測(cè)序檢測(cè)脫靶。全基因組測(cè)序，直接檢測(cè)切割位點(diǎn)，能檢測(cè)低頻脫靶突變。浙江種子脫靶檢測(cè)CRO