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來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-04-24

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧:一、脂質(zhì)體(Liposome)轉(zhuǎn)染方法原理脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分普遍,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體,DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面,經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn):與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復(fù)性,它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前條件下較方便的轉(zhuǎn)染方法之一瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,可在48h-72h細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)之后,提取細(xì)胞蛋白或者RNA。鄭州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠(chǎng)家批發(fā)價(jià)

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑:1.試劑過(guò)期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下,還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過(guò)期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年,百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),原來(lái)是Lipofectamine2000過(guò)期了。換了之后,立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn),盡量使用開(kāi)封半年內(nèi)的,因?yàn)檫^(guò)了半年后,就算沒(méi)有過(guò)失效期,但是細(xì)胞毒性較大增加,而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬(wàn)不要為了省錢(qián),影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn),其實(shí)也可以在原來(lái)的無(wú)血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個(gè)時(shí)候,較好不要換液,不要打擾細(xì)胞,讓它安安靜靜地休息。但是也不能過(guò)早加入血清。過(guò)早的話(huà),會(huì)引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長(zhǎng)。那么,什么是較佳時(shí)機(jī)呢?在20%的細(xì)胞變圓的時(shí)候,就是加血清的較佳時(shí)機(jī)。鄭州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠(chǎng)家批發(fā)價(jià)重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,較好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。

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轉(zhuǎn)染方式:細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成,這對(duì)大分子物質(zhì)來(lái)說(shuō)是個(gè)不可透過(guò)的屏障,比如DNA和RNA的磷酸骨架,其也帶負(fù)電荷。為了使核酸穿過(guò)細(xì)胞膜,研究人員開(kāi)發(fā)了多種技術(shù),大致分為三類(lèi):化學(xué)方法---利用載體分子包被核酸使其呈現(xiàn)中性電荷或正電荷。生物方法---利用基因工程細(xì)菌轉(zhuǎn)染非細(xì)菌基因到細(xì)胞中。物理方法---在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)的孔從而導(dǎo)入DNA。然而,沒(méi)有一種方法適用于所有的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn),理想的方法應(yīng)根據(jù)您的細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇,理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率,低細(xì)胞毒性和對(duì)正常生理學(xué)的影響較小,并且易于使用和可重復(fù)性等特點(diǎn)。

轉(zhuǎn)染效率:線(xiàn)型PEI(LinePEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI(BranchedPEI,BPEI)要早一些,過(guò)去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低,有利于細(xì)胞定位,因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但較近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,從而提高轉(zhuǎn)染效率,但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大。超很高枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低,但轉(zhuǎn)染效率卻較高。GenEscort是采用各種分枝狀和超很高枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián),合成出的一系列很高枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性,因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒,從而提高轉(zhuǎn)染效率,當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后,其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解,使交聯(lián)聚合物分解為無(wú)細(xì)胞毒性的小分子PEI,這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性,其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋。

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穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選:生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉(zhuǎn)染后,在開(kāi)始篩選前等待48-72小時(shí),使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶,保證在開(kāi)始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基,加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基,物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線(xiàn)確定,足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,包括細(xì)胞類(lèi)型,培養(yǎng)基和血清濃度等,所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線(xiàn),確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時(shí)間,因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN物品存在條件下,細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的物品,一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌梢苑謩e純化(克隆),收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。通過(guò)緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓。濟(jì)南正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商

因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大,實(shí)驗(yàn)必須很小心。鄭州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠(chǎng)家批發(fā)價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染,你至少要掌握以下幾點(diǎn):主要有下面幾種方法::化學(xué)法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法;物理法:電穿孔法、顯微注射法、顆粒傳遞法;細(xì)菌介導(dǎo)法:逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌、腺細(xì)菌A.陽(yáng)離子脂質(zhì)體法:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點(diǎn):簡(jiǎn)單通用,適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清,轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類(lèi)型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞,所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。B.電穿孔法:利用高壓電脈沖對(duì)細(xì)胞膜的干擾,使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔鄭州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠(chǎng)家批發(fā)價(jià)

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