TaqMan 方法的優(yōu)點(diǎn)：需要在探針和目標(biāo)分子（靶點(diǎn)）之間發(fā)生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號(hào)。可使用明顯不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測(cè)兩個(gè)不同的序列。無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。TaqMan方法的缺點(diǎn)：TaqMan方法的主要缺點(diǎn)在于需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。SYBR Green I染料試劑。一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結(jié)合的小分子分為以下兩類：嵌入劑、小溝結(jié)合物。無論哪種結(jié)合方法，用于PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)的DNA結(jié)合染料都需要滿足以下兩個(gè)條件：結(jié)合至雙鏈DNA時(shí)，會(huì)有增強(qiáng)的熒光對(duì) PCR 不會(huì)產(chǎn)生抑制我們開發(fā)更加優(yōu)化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生抑制并帶來相對(duì)于溴化乙錠更為靈敏的檢測(cè)。Quantagene q225系列qPCR 43分鐘完成實(shí)驗(yàn)，加3分鐘做完熔解曲線只需43分鐘即可完成40循環(huán)的常規(guī)qpcr實(shí)驗(yàn)。珠三角快速qPCR儀使用說明

陰性對(duì)照一般是指用水代替模板的反應(yīng)孔，體系中除了模板，包括了其他的反應(yīng)組分。由于qPCR的高靈敏性，陰性對(duì)照有出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的情況，那么在針對(duì)這類問題時(shí)，我們需要判斷其原因所在。使用染料法進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先查看陰性對(duì)照的溶解曲線主峰是否跟陽(yáng)性孔的主峰位置一致。如果一致，要看兩者Cq相差多少，比如，針對(duì)某一種引物的實(shí)驗(yàn)樣品Cq值為28. 5，陰性對(duì)照的Cq值為33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的擴(kuò)增效率計(jì)算，兩者模板量相差28倍之多，對(duì)分析數(shù)據(jù)影響不大，所以實(shí)驗(yàn)樣品的Cq值還是可以采用的；但是，如果兩者的Cq值相差 1~2，這說明陰性對(duì)照中有較大的模板污染，則需要考慮更換試劑或引物，分區(qū)加樣，重新實(shí)驗(yàn)。如果不一致，陰性對(duì)照主峰對(duì)應(yīng)的Tm值小于陽(yáng)性孔的Tm值，則可能是引物性能不好，無模板或使用低濃度模板下會(huì)出現(xiàn)引物二聚體，這種情況則需要考慮更換引物，保證引物特異性以及擴(kuò)增效率。珠三角快速qPCR儀使用說明PCR 反應(yīng)中通過控制溫度變化使得核酸分子重復(fù)地解鏈與延伸，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的指數(shù)擴(kuò)增。

免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物使用抗體捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。抗體免疫沉淀并從細(xì)胞核組分中分離蛋白質(zhì)，去除不相關(guān)的細(xì)胞物質(zhì)。使用抗體結(jié)合磁珠完成所得抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的純化。經(jīng)過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化:現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲(chǔ)存。

與標(biāo)準(zhǔn) PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性、退火和延伸階段組成。 不同之處在于，您在 qPCR 設(shè)置期間將一些雙鏈 DNA 結(jié)合染料 SYBR Green I 添加到預(yù)混液中。 這種熒光染料在延伸階段嵌入到雙鏈 DNA 序列中，顯示出熒光信號(hào)的強(qiáng)烈增加。 在每個(gè)熱循環(huán)結(jié)束時(shí)測(cè)量此信號(hào)將使您能夠確定存在的雙鏈 DNA 的數(shù)量。SYBR Green 檢測(cè)的缺點(diǎn)是染料會(huì)與任何雙鏈 DNA 序列結(jié)合。 這意味著您還可以檢測(cè)非特異性 qPCR 產(chǎn)物（例如引物二聚體）發(fā)出的熒光。 為消除這種風(fēng)險(xiǎn)，通過執(zhí)行熔解曲線分析檢查反應(yīng)特異性，或使用 TaqMan 方法。q225 出色的熱循環(huán)系統(tǒng)設(shè)計(jì)使得40 個(gè)循環(huán)的常規(guī) qPCR 可以在短短43 分鐘內(nèi)輕松完成，讓您的工作效率獲得質(zhì)提升 。

內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用：由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響：若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為***。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。終點(diǎn)法檢測(cè)（也稱 “讀板檢測(cè)”）測(cè)量的是PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。珠三角快速qPCR儀使用說明

qPCR只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量，即必須使用標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能進(jìn)行定量。珠三角快速qPCR儀使用說明

qPCR中的熒光探針是一種短鏈寡核苷酸，帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，它可以特異結(jié)合目的產(chǎn)物的DNA序列。其檢測(cè)原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），即熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)在目標(biāo)DNA分子擴(kuò)增過程中因?yàn)榫酆厦傅耐馇谢钚詮亩夥蛛x使熒光信號(hào)的釋放；隨著擴(kuò)增過程的推進(jìn)，機(jī)器實(shí)時(shí)檢測(cè)增強(qiáng)的熒光信號(hào)，從而產(chǎn)生終的熒光擴(kuò)增曲線。根據(jù)修飾基團(tuán)標(biāo)記和能量轉(zhuǎn)移方式，可以將探針分為TaqMan探針、分子信標(biāo)和其他探針。TaqMan探針（熒光淬滅水解探針）現(xiàn)今常用的TaqMan探針主要是水解探針，其多是5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)的短單鏈寡聚核苷酸。在qPCR反應(yīng)中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，對(duì)TaqMan探針進(jìn)行切割，使熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)不會(huì)被淬滅，釋放的熒光信號(hào)被機(jī)器接收。TaqMan探針的qPCR相比于染料法多了一條TaqMan探針，可以特異性結(jié)合DNA序列，因而具有更好的特異性，但探針合成價(jià)格偏高。珠三角快速qPCR儀使用說明

廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司專注技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)品研發(fā)，發(fā)展規(guī)模團(tuán)隊(duì)不斷壯大。一批專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，是實(shí)現(xiàn)企業(yè)戰(zhàn)略目標(biāo)的基礎(chǔ)，是企業(yè)持續(xù)發(fā)展的動(dòng)力。公司以誠(chéng)信為本，業(yè)務(wù)領(lǐng)域涵蓋數(shù)字PCR，純水機(jī)，病理切片機(jī)，倍性分析儀，我們本著對(duì)客戶負(fù)責(zé)，對(duì)員工負(fù)責(zé)，更是對(duì)公司發(fā)展負(fù)責(zé)的態(tài)度，爭(zhēng)取做到讓每位客戶滿意。公司深耕數(shù)字PCR，純水機(jī)，病理切片機(jī)，倍性分析儀，正積蓄著更大的能量，向更廣闊的空間、更寬泛的領(lǐng)域拓展。