相對定量實驗方法包括兩種重要方法：ΔΔCT Method：使用內參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內參基因與目的基因可以同時反應，也可以單獨反應；雙標準曲線法：對每個樣品的內參基因和目的基因都做定量，求出每個樣品中內參基因和目的基因的數量，然后根據相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。定量需要由標準曲線建立Ct值跟拷貝數之間的關系，標準曲線由標準品生成，標準品可以是已知濃度的RNA、質粒或合成的寡核苷酸鏈生成，定量未知模板時標準樣品和未知樣品必須同時反應。實時熒光定量PCR指在PCR反應體系加入熒光基團，熒光信號實時監測PCR,通過標準曲線對未知模板進行定量分析.珠海快速qPCR儀設置

PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當的緩沖體系。PCR 產物的增長形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N 是循環數)。實際中，擴增效率不為100％。Real time PCR 是定量PCR 的一種，當然是在PCR 的基礎上發展出來的。（普通）PCR 包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環數，程序，PCR 產物（擴增子，amplicon）的量，擴增曲線（擴增子累積曲線），摻錯率，擴增子長度。一般來說，人們關心的是擴增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴增曲線（amplification curve）, 循環數；擴增子長度，擴增效率，擴增子多少，也加以考慮。珠海快速qPCR儀設置TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環過程中隨著特定PCR產物的累計而對其進行檢測。

原理：在DNA擴增反應中，通過熒光化學物質測定每次PCR循環后產物總量。目的：實現定量而不止是定性分析。通過與內參基因進行對比，對樣品中的特定基因進行相對表達量的計算，以實現定量分析。qPCR的檢測方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針法，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，使其特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增。

雙雜交探針是兩個特異性探針，一個只5’端標記熒光基團，另一個只3’端標記猝滅基團。這兩個探針序列和模板特異性結合，結合的位置非常鄰近。在qPCR反應的退火階段，當兩個探針與模板結合時，位于兩個探針頭尾的熒光基團之間產生FRET現象，促進受體的熒光基團釋放一種波長的熒光信號，從而達到實時監控反應進程的目的。Amplifluor系統包括兩個特異性引物和一條檢測探針（UniPrimer），其中一條引物的5’末端帶有部分序列和UniPrimer的3’末端部分序列相同。UniPrimer兩端分別被熒光和淬滅基團標記且有發卡結構。反應時，UniPrimer結合到特異性引物擴增出的模板上作為引物進行PCR反應，在延伸的過程中UniPrimer發夾結構打開，熒光信號釋放。蝎形引物為莖環結構，其5’端帶有一個熒光基團FAM，3’端帶有一個淬滅基團DABCYL，其環的部分序列和模板完全互補配對。體系有模板時，莖環結構穩定，熒光和淬滅基團相距近，不能檢出熒光信號；體系無模板時，蝎形引物和模板特異性結合并起始PCR擴增，蝎形引物的環結構與擴增出的模板互補雜交，導致莖環結構被破壞，釋放出大量的熒光信號，熒光儀器可以實時收集這些熒光信號并生成相應的熒光擴增曲線。dPCR比qPCR準確度與精密度高。

交聯和裂解——穩定復合物并分離核組分:第一步對時間要求嚴格并且需要優化。體內共價交聯穩定蛋白質-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯，加入甘氨酸以終止反應。交聯劑滲透到完整細胞中并將蛋白質-DNA復合物鎖定在一起從而進行分析。交聯劑在整個過程中保持復合物穩定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯。接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質-DNA復合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。自聚合酶鏈式反應技術被發明以來，其簡單、可靠、快速、靈敏的質量，PCR是分子生物學中使用的技術。深圳酷博qPCR儀應用

Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統：快速 分秒必爭，43 分鐘完成40 循環qPCR 實驗。珠海快速qPCR儀設置

TaqMan 方法的優點：需要在探針和目標分子（靶點）之間發生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號。可使用明顯不同的報告基因染料標記探針，在一個反應管內擴增并檢測兩個不同的序列。無需PCR后處理，減少分析工作量并節省材料成本。TaqMan方法的缺點：TaqMan方法的主要缺點在于需要根據不同的序列，合成不同的探針。SYBR Green I染料試劑。一般將可與雙鏈DNA發生結合的小分子分為以下兩類：嵌入劑、小溝結合物。無論哪種結合方法，用于PCR實時檢測的DNA結合染料都需要滿足以下兩個條件：結合至雙鏈DNA時，會有增強的熒光對 PCR 不會產生抑制我們開發更加優化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會對PCR產生抑制并帶來相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。珠海快速qPCR儀設置

廣州雙螺旋科學儀器有限公司致力于精細化學品，是一家服務型公司。公司業務分為數字PCR，純水機，病理切片機，倍性分析儀等，目前不斷進行創新和服務改進，為客戶提供良好的產品和服務。公司將不斷增強企業重點競爭力，努力學習行業知識，遵守行業規范，植根于精細化學品行業的發展。雙螺旋科學儀器憑借創新的產品、專業的服務、眾多的成功案例積累起來的聲譽和口碑，讓企業發展再上新高。