細胞在受到外界刺激時，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續存在，Ca2+熒光信號不但不會繼續增強，反而會減弱，直至恢復到未加刺激物時的水平。對于細胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化情況，研究發現，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發生任何變化，而配子之間發生融合作用時，Ca2+熒光信號強度卻會出現一個不穩定的峰值，并可持續幾分鐘。這些現象，對研究受精發育的早期信號及Ca2+在卵細胞和受精卵的發育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細胞分裂、胞吐作用等等，Ca2+熒光信號強度也會發生很強的變化。多光子激光掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質的層析成像問題, 擴大了應用范圍。美國清醒動物多光子顯微鏡技術

我們要指出的是，單光子激發熒光和雙光子激發熒光，是從熒光產生的機理上來區分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結構，其目的是為了，通過共焦結構，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據激發光源的不同，實現單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結構）其空間分辨率也可以達到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個系統，相對來說，就提高了激發光源的利用率，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應和共焦結構，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發熒光的。飛秒激光多光子顯微鏡層析成像從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術通常也被統稱為多光子顯微鏡。

快速光柵掃描有多種實現方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調電動透鏡結合在一起進行快速3D掃描，但可調電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現可使用空間光調制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調控M的位置實現軸向掃描。該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統需要依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。

Ca2+是重要的第二信使，對于調節細胞的生理反應具有極其重要的作用，開發和利用雙光子熒光顯微成像技術對Ca2+熒光信號進行觀測，可以從某些方面對有機體或細胞的變化機制進行分析，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術可以觀察細胞內用熒光探針標記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化，還可以觀察細胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細胞的研究發現，Ca2+不僅在細胞局部區域間的分布是不均勻的，而且細胞內各局部區域的不同深度或層次間也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。多光子成像是一種非線性的過程，信號產生要求功率密度達到MW/cm2的量級。

有許多方法可以實現快速光柵掃描，例如使用振鏡進行快速2D掃描，以及將振鏡與可調電動透鏡相結合進行快速3D掃描。而可調電動式鏡頭由于機械慣性的限制，無法在軸向快速切換焦點，影響成像速度?，F在它可以被空間光調制器(SLM)取代。遠程對焦也是實現3D成像的一種手段，如圖2所示。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調整M的位置實現軸向掃描該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來放大FOV。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動以進行快速軸向掃描，因此大FOV系統依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。多光子顯微鏡已經被生物學家普遍的運用于實驗中。Ultima 2P Plus多光子顯微鏡設備

多光子顯微鏡市場集中，由于投產生產的成本較高，技術難度大，目前涌現的新企業不多。美國清醒動物多光子顯微鏡技術

    多光子激光掃描顯微鏡行業發展，世界多光子激光掃描顯微鏡產業主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業占據著世界多光子激光掃描顯微鏡市場64.44%的市場份額，其發展戰略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發展在中國將具有很大的發展潛力。美國清醒動物多光子顯微鏡技術

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