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雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子;其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙(多)光子成像優(yōu)勢(shì)在于,具有更深的組織穿透深度,利用紅外光,能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域;因信號(hào)背景比高,而具有更高的對(duì)比度;因激發(fā)體積小,具有定點(diǎn)激發(fā)的特性,具有更少的光毒性;激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見(jiàn)光調(diào)整為紅外激發(fā),能夠更加地安全。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個(gè)光子的能量相加達(dá)到熒光激發(fā)能量閾值,來(lái)激發(fā)樣品中熒光分子發(fā)出熒光信號(hào)。國(guó)內(nèi)ultima雙光子顯微鏡成像原理是什么
通過(guò)對(duì)顯微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì),將FHIRM-TPM2.0的成像視場(chǎng)擴(kuò)展至420×420平方微米,顯微物鏡的工作距離擴(kuò)展至1mm,實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊,實(shí)現(xiàn)深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像。該模塊由一個(gè)快速電動(dòng)變焦鏡頭和一對(duì)中繼鏡頭組成,在不同深度成像時(shí)保持放大率恒定。其中,變焦模塊重1.8克,科研人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求自由拆卸。此外,新型微型成像探頭可以瞬間插拔,極大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作,避免了長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的干擾。反復(fù)裝卸探針追蹤同批神經(jīng)元時(shí),視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角度小于0.07弧度,邊界偏差小于35微米。國(guó)內(nèi)ultima雙光子顯微鏡光子探測(cè)雙光子顯微鏡的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。
WinfriedDenk使用的第1個(gè)光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs,可見(jiàn)光波長(zhǎng)630nm)。染料激光雖然實(shí)驗(yàn)室演示可以接受,但是使用起來(lái)不方便,所以離商業(yè)化還很遠(yuǎn)。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)光源變成了飛秒鈦寶石激光器。鈦寶石激光器除了具有固態(tài)光源的優(yōu)點(diǎn)外,還具有近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍寬,而近紅外比可見(jiàn)光穿透更深,對(duì)生物樣品的損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)左側(cè)。從雙光子到三光子科學(xué)家們正在從雙光子顯微鏡轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk的導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博時(shí)發(fā)明了三光子顯微鏡。如果雙光子吸收是可行的,那么三光子似乎是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),大約1.3和1.7微米,成像深度比雙光子更深。目前錄音大約2.2毫米,人的大腦皮層厚度大約4毫米。與雙光子顯微鏡相比,三光子需要使用更強(qiáng)、更短、重復(fù)率更低的激光脈沖,這是傳統(tǒng)的鈦寶石激光器很難滿(mǎn)足的,但對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器,比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易。
其實(shí)電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或者存在的比較大意義,準(zhǔn)確的來(lái)說(shuō),不在于放大倍數(shù),而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。通俗的來(lái)說(shuō),就是進(jìn)行觀察的時(shí)候,除了要將物體放大,還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開(kāi)來(lái)。如果兩個(gè)相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下,即使放大到很大,看到的可能卻是兩個(gè)相交的亮斑(艾里斑),而沒(méi)有明顯的界限(更不用說(shuō)細(xì)節(jié)了),這表示是分辨率不夠。拋開(kāi)分辨率談放大倍數(shù)是沒(méi)有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,約等于光波波長(zhǎng)的一半,通常被說(shuō)成是光學(xué)顯微鏡放大極限,其實(shí)準(zhǔn)確地來(lái)說(shuō),應(yīng)該叫做分辨率的極限。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射,根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性,于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能。電子顯微鏡也有多種,題主說(shuō)的是像REM的。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的,比如低能電子衍射(LEED)和透射電鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體,根據(jù)其周期性的特點(diǎn)而生成倒易空間里的衍射圖像,借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實(shí)空間,得到真正的晶體表面圖像了。雙光子顯微鏡的探測(cè)器,該怎么選用?
WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深,對(duì)生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊??茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,如果雙光子吸收可行,那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),大約在1.3和1.7微米,其成像深度也比雙光子更深,目前記錄約為2.2毫米,人類(lèi)大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、有生命體的觀察!國(guó)內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)
雙光子顯微鏡的原理是什么?國(guó)內(nèi)ultima雙光子顯微鏡成像原理是什么
使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng);成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說(shuō)太快。目前電壓成像主要通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像,需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,虛擬源越遠(yuǎn),物鏡處的光束尺寸越大,焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿(mǎn)物鏡,從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,y軸的橫向分辨率為0.35μm。國(guó)內(nèi)ultima雙光子顯微鏡成像原理是什么