細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí)，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系，較終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等。鈣信號(hào)在大腦皮層中更能反映神經(jīng)元的活性,因此神經(jīng)元鈣信號(hào)的檢測(cè)對(duì)研究大腦皮層功能至關(guān)重要。哈爾濱神經(jīng)細(xì)胞鈣成像價(jià)位

雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長(zhǎng)波激發(fā)，能對(duì)組織進(jìn)行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長(zhǎng)大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對(duì)這個(gè)波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測(cè)。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個(gè)樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的gaofen辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個(gè)樹突棘中的鈣分布。鈣成像大概費(fèi)用可以對(duì)深部腦區(qū)、皮層區(qū)域等大部分腦區(qū)進(jìn)行鈣成像使用鈣離子指示蛋白。

目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個(gè)神經(jīng)元中。此方法方便實(shí)驗(yàn)者控制單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元，觀察對(duì)象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動(dòng)作電位相關(guān)性的活動(dòng)。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細(xì)胞注射法；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）

傳統(tǒng)的寬場(chǎng)熒光顯微鏡由于光散射的影響，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進(jìn)行成像，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行活動(dòng)動(dòng)物成像的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。例如，用雙光子顯微鏡對(duì)海馬樹突棘的鈣離子信號(hào)進(jìn)行成像，研究神經(jīng)元突觸后長(zhǎng)時(shí)程yizhi(Wangetal.,2000)；觀察活動(dòng)小鼠運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元在嗅覺選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位(Komiyamaetal.,2010)等等。不過，這些實(shí)驗(yàn)還是需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉和固定，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒?dòng)的動(dòng)物進(jìn)行研究。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。

使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鈣成像時(shí)，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場(chǎng)上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對(duì)AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被guangfan的使用。清醒動(dòng)物腦功能鈣成像的微型顯微鏡的研究在不斷實(shí)踐中。北京鈣成像口碑好

鈣離子是哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的重要信使。哈爾濱神經(jīng)細(xì)胞鈣成像價(jià)位

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針與紫外光激發(fā)探針相比，可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強(qiáng)的染料吸收性能，對(duì)Ca2+變化水平檢測(cè)敏感度也更高，能夠降低對(duì)活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾，且無光譜偏移。常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2等，同時(shí)他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一，是典型的的單波長(zhǎng)指示劑，比較大激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)為526nm。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無熒光，結(jié)合后熒光會(huì)增加60至100倍，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530nm。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中。它還有一個(gè)升級(jí)版本Fluo-4，在相同Ca2+濃度下信號(hào)更強(qiáng)。哈爾濱神經(jīng)細(xì)胞鈣成像價(jià)位