在酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)操作中，加樣是必不可少的項(xiàng)步驟，這步驟在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中都有著很大的影響。那么酶聯(lián)免疫加樣步驟問(wèn)題應(yīng)如何解決處理呢？

一、加樣問(wèn)題的可能原因  

1.血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣；

2.手工操作中，加樣板過(guò)多造成加樣后放入孵箱等待時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(特別是室內(nèi)溫度較高時(shí))；

3.加完標(biāo)本再加酶試劑時(shí)酶濺出孔外。

二、解決方法

1.標(biāo)本為血清：將血液先自然存放1-2小時(shí)后，再用3000rmp離心15分鐘；標(biāo)本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，**后必須立即顛倒**管混合5-10次，放置段時(shí)間后，3000rpm離心15分鐘；若在幾天內(nèi)檢測(cè)，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。

2.加樣后及時(shí)放入孵箱。

3.加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。

4.如果采用AT或其他全自動(dòng)加樣，選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。

5.標(biāo)本較多時(shí)，請(qǐng)分批操作。

小建議：在整個(gè)操作過(guò)程中必須保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸，實(shí)現(xiàn)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化，有效提高檢測(cè)質(zhì)量。

競(jìng)爭(zhēng)法也是一種很常用的方法，一起看看：

競(jìng)爭(zhēng)法（Competitive ELISA）是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體（或抗原）濃度越高，則能與固定抗原（或抗體）結(jié)合的酶標(biāo)抗體（或抗原）就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對(duì)照相比，顯色越淺，表示檢測(cè)樣本中抗體（或抗原）含量越高。

該法特別適合小分子物質(zhì)的檢測(cè)也可用于檢測(cè)比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測(cè)的靈敏度和專一性較差。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原常用于檢測(cè)小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個(gè)以上的識(shí)別位點(diǎn)，不適用于雙抗夾心法進(jìn)行測(cè)定。該方法在商業(yè)化ELISA試劑盒中被廣fan運(yùn)用。 分選試劑盒以GFP作為標(biāo)記的質(zhì)粒可替代抗生su的作用，可以幫助識(shí)別哪些細(xì)胞成功地轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒。

細(xì)胞毒性是由合成化合物、細(xì)胞自然產(chǎn)生毒性或免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞(如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,自然殺傷細(xì)胞等)引起的細(xì)胞殺傷事件。目前主要通過(guò)對(duì)受損細(xì)胞釋放的相關(guān)底物(如乳酸脫氫酶-LDH)進(jìn)行定量,從而判斷細(xì)胞膜的受損情況。本期，將為大家講解有關(guān)細(xì)胞毒性的檢測(cè)產(chǎn)品、原理及特點(diǎn)等內(nèi)容。

細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)是生物相容性測(cè)試的一種，檢測(cè)藥物或者新型材料在生物環(huán)境中的毒性情況，即通過(guò)檢測(cè)材料或者藥物對(duì)細(xì)胞的增殖或者生長(zhǎng)的影響，來(lái)評(píng)價(jià)藥物或材料的毒性或者活性，主要用于藥物活性篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、抗**藥效測(cè)定等；常用MTT法或者CCK-8法檢測(cè)，另外也可以通過(guò)Live/dead雙染法進(jìn)行細(xì)胞成像，更直觀的記錄細(xì)胞的存活情況。

報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用于篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織。在過(guò)去的10年里，熒光蛋白已經(jīng)成為活細(xì)胞成像研究中不可或缺的一部分。DsRED是可與其他篩選標(biāo)記進(jìn)行雙標(biāo)記，同時(shí)又能避免植物葉綠素自發(fā)熒光的理想報(bào)告基因。本研究利用含有表達(dá)DsRED的雙元載體pKGWRR轉(zhuǎn)化核桃體細(xì)胞胚，并對(duì)這種紅色熒光蛋白可視報(bào)告基因?qū)ε咛ズ驮偕仓甑挠绊戇M(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，DsRED熒光強(qiáng)度在7~10d達(dá)到*高，24個(gè)存活的體細(xì)胞胚中有14個(gè)檢測(cè)到紅色熒光。這些E0胚每2周可以獲得25個(gè)全熒光E1胚和43個(gè)全熒光E2胚。DsRED陽(yáng)性胚的發(fā)芽率達(dá)80%以上，獲得了45株可以檢測(cè)到紅色熒光的轉(zhuǎn)基因核桃植株。再生轉(zhuǎn)基因植株的組織中均能檢測(cè)到DsRED表達(dá)，包括其營(yíng)養(yǎng)器guan的橫切面。轉(zhuǎn)化植株中能形成根的百分比(48.3%)與對(duì)照(53%)相近。在核桃體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)化體系中，DsRED的報(bào)告系統(tǒng)比綠色熒光蛋白(GFP)更穩(wěn)定可靠，且其具有直觀和非損傷的特點(diǎn)，提供了一種比b-葡萄糖醛酸酶(GUS)更有效的檢測(cè)轉(zhuǎn)化的手段。示蹤試劑盒中所使用的熒光探針具有極低細(xì)胞毒性和無(wú)生物活性的特點(diǎn)。

      細(xì)胞凋亡晚期,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。ELISA試劑盒，抗體檢測(cè)才是趨勢(shì)。藥敏試劑盒

細(xì)胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)從而找到較好測(cè)定時(shí)間。穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

ELISA是一種基于酶的免疫測(cè)定方法，由于酶標(biāo)的放大作用，利用酶標(biāo)記抗體的免疫檢測(cè)，因其高特異性和敏感性而日益受到人們的青睞。細(xì)胞因子夾心ELISA是一種敏感的酶免疫分析方法，可以特異性地檢測(cè)和定量可溶性細(xì)胞因子和趨化因子蛋白的濃度。這一方法的基本原理是：①將已知抗體結(jié)合到某種固相載體表面；②加待測(cè)抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結(jié)合，然后把多余抗體洗除；③加入與待測(cè)抗原呈特異反應(yīng)的酶聯(lián)抗體，使形成“夾心”；④加入該酶的底物，若看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，說(shuō)明在孔壁上存在相應(yīng)的抗原，利用酶標(biāo)儀測(cè)其OD值。有色產(chǎn)物的量與待測(cè)抗原的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

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1、原代細(xì)胞：ScienCell（中國(guó)區(qū)正規(guī)一級(jí)代理）人源和動(dòng)物源各種原代細(xì)胞。

2、培養(yǎng)基：原代細(xì)胞**低血清、無(wú)血清、無(wú)異源蛋白無(wú)動(dòng)物成分培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清、原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、ELISA試劑盒、定量PCR芯片試劑盒、DNA/RNA及細(xì)胞裂解物等。

4、細(xì)胞系（株）：種類豐富（1000余種），已通過(guò)STR鑒定；提供細(xì)胞株完全培養(yǎng)基。

5、自研產(chǎn)品：支原體檢測(cè)/qing除試劑盒、端粒酶檢測(cè)試劑盒、人源/動(dòng)物源ELISA試劑盒等系列產(chǎn)品。

6、技術(shù)服務(wù)：綠/紅色熒光蛋白標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記、慢bing毒介導(dǎo)基因沉默或過(guò)表達(dá)及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建，細(xì)菌基因敲除、細(xì)胞基因敲除、小鼠基因敲除、血管生成功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。