T7EndonucleaseI(T7EI)在CRISPR/Cas9基因編輯中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在突變體檢測和基因編輯效率評估上。以下是T7EI在CRISPR/Cas9中的具體應(yīng)用步驟和特點：1.**基因編輯效率評估**：-T7EI用于評估CRISPR-Cas9在給定的導(dǎo)向RNA靶位點上對細胞群體進行基因編輯的效率。-通過PCR擴增圍繞CRISPR導(dǎo)向RNA靶位點的基因組DNA，如果CRISPR-Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)事件引入了突變，變性和退火將形成突變型和野生型PCR擴增子的異源雙鏈DNA。2.**突變體檢測**：-如果CRISPR/Cas9編輯成功在DNA上引入突變，則可與野生型DNA片段退火產(chǎn)生異質(zhì)雙鏈DNA。T7EI可以識別該DNA上的不完全配對的DNA位點然后進行雙鏈切割，通過瓊脂糖凝膠電泳即可顯示酶切后的條帶，從而半定量判定基因編輯效果。-T7EI能識別長度大于或等于2bp的插入、缺失或突變導(dǎo)致的錯配DNA，不能識別1bp的插入、缺失或突變。3.**實驗步驟**：-收集細胞并提取基因組DNA，然后使用PCR擴增期望編輯的基因組區(qū)域。擴增子的長度建議為0.5-1kb。-對擴增的DNA進行變性和退火復(fù)性，以產(chǎn)生異質(zhì)雙鏈DNA。-使用T7EI酶處理退火后的DNA產(chǎn)物，在37℃孵育15分鐘。

ExoIII（ExonucleaseIII）和Lambda核酸外切酶（λExonuclease）在DNA末端處理上的主要不同點如下：1.**作用方向**：-**ExoIII**：具有3'→5'外切脫氧核糖核酸酶活性，它從DNA鏈的3'-OH末端逐步切去單核苷酸。-**Lambda核酸外切酶**：是一種5'→3'核酸外切酶，能選擇性地沿5'→3'方向消化5'端磷酸化的雙鏈DNA。2.**底物特異性**：-**ExoIII**：適底物是平末端或5'末端突出的DNA，但也可以作用于雙鏈DNA切刻位點產(chǎn)生單鏈缺口。由于對單鏈DNA無活性，因此難以切割3'突出末端。-**Lambda核酸外切酶**：適底物是5'磷酸化的雙鏈DNA，對單鏈DNA和5'端未磷酸化修飾的DNA的酶切活性較低，不能從DNA的切刻或缺口處起始消化。3.**活性差異**：-**ExoIII**：對具有3'-突出末端(至少有4個堿基，且具有3'-末端C殘基)的DNA、單鏈DNA、硫代磷酸酯連接的核苷酸無活性。-**Lambda核酸外切酶**：對5'-OH端的切割速度比5'-P端慢約20倍；對單鏈DNA的酶切速度比雙鏈DNA慢約100倍。4.**應(yīng)用場景**：-**ExoIII**：可以用于生產(chǎn)特定方向的單鏈DNA，將線性化DNA設(shè)計成為一端為不切割末端（3'突出端），另一端則設(shè)計為易切割末端（平端或5'突出端）。

Lambda核酸外切酶（λExonuclease）在PCR產(chǎn)物的克隆中主要應(yīng)用在以下幾個方面：1.**單鏈DNA的生成**：-Lambda核酸外切酶可以用于從雙鏈DNA中生成單鏈DNA。由于該酶沿5'→3'方向逐步切去5'單核苷酸，底物是5'磷酸化的雙鏈DNA，因此可以用來消化PCR產(chǎn)物中的一條鏈，從而生成單鏈DNA，這對于某些克隆技術(shù)來說是必要的步驟。2.**PCR產(chǎn)物的克隆**：-在克隆過程中，有時需要將PCR產(chǎn)物的5'端磷酸化，以便與載體連接。Lambda核酸外切酶可以消化非磷酸化的DNA，從而在一定程度上幫助準備適合克隆的PCR產(chǎn)物。3.**減少自身環(huán)化和非特異性連接**：-在連接反應(yīng)中，為了減少質(zhì)粒載體的自身環(huán)化，可以使用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒DNA以去除5'磷酸基團。而Lambda核酸外切酶可以消化5'端磷酸化的DNA，因此在某些情況下，它可以輔助減少PCR產(chǎn)物的自身環(huán)化，尤其是在PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)中。4.**提高克隆效率**：-通過消化PCR產(chǎn)物中的一條鏈，Lambda核酸外切酶可以幫助減少PCR產(chǎn)物的非特異性連接，從而提高克隆的效率和準確性。綜上所述，Lambda核酸外切酶在PCR產(chǎn)物的克隆中主要通過生成單鏈DNA、準備適合克隆的PCR產(chǎn)物、減少自身環(huán)化和非特異性連接以及提高克隆效率等方面發(fā)揮作用。

蛋白A-微球菌核酸酶（pA-MNase）是一種特殊的融合蛋白，它結(jié)合了蛋白A和微球菌核酸酶（MNase，MicrococcalNuclease）的特性。以下是pA-MNase的一些關(guān)鍵特點和應(yīng)用：1.**融合表達產(chǎn)物**：pA-MNase是蛋白A與微球菌核酸酶MNase的融合表達產(chǎn)物，因此它同時具有ProteinA的抗體結(jié)合活性和MNase的核酸內(nèi)切酶活性。2.**雙重功能**：由于其雙重功能，pA-MNase常用于蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究，特別是在ChIC（ChromatinImmunocleavage）和CUT&RUN（CleavageUnderTargetsandReleaseUsingNuclease）技術(shù)中。3.**ProteinA的特性**：ProteinA是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的細胞壁表面蛋白，分子量為42kDa，能特異性地與哺乳動物免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）結(jié)合，通常結(jié)合部位為免疫球蛋白的Fc區(qū)。4.**微球菌核酸酶（MNase）的特性**：MNase是一種核酸內(nèi)切酶，能夠降解核酸，常用于降解蛋白質(zhì)制備中存在的核酸，減少細胞裂解液的粘度，以及用于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和快速RNA測序。5.**反應(yīng)條件**：MNase的反應(yīng)條件包括1XMicrococcalNucleaseReactionBuffer，需要補充100μg/ml重組白蛋白，分子生物學(xué)級，并在37°C下孵化?？梢岳矛F(xiàn)有的計算工具，如CRISPR design tools，預(yù)測gRNA的活性和特異性，以輔助實驗設(shè)計 。

T5核酸外切酶在基因編輯中確實有應(yīng)用，并且具有一些優(yōu)勢：1.**提高編輯效率**：根據(jù)一篇研究文章，T5核酸外切酶可以與CRISPR/Cas系統(tǒng)共表達或融合，以提高基因編輯的效率。這種共表達或融合可以增加indel（插入和缺失）頻率，盡管增加的幅度可能不大。2.**增強基因編輯效果**：在另一項研究中，通過使用螺旋-螺旋二聚體肽（coiled-coilpeptides）將T5核酸外切酶招募到Cas9或Cas12a蛋白上，可以提高基因編輯的效率，這種方法被稱為CCExo（CRISPR-Coiled-coil-Exonuclease）。這種招募方式優(yōu)于共表達和直接融合，其中強的親和力CC對顯示出高的突變頻率和刪除長度。3.**應(yīng)用于多種細胞類型**：CCExo系統(tǒng)在多種細胞系和原代細胞中都能有效地提高基因失活效率，并且在慢性髓性白血?。–ML）患者的原代細胞以及異種移植動物模型中展示了其應(yīng)用潛力，這表明CCExo方法可能成為CML和其他遺傳性疾病的潛在選擇。T5核酸外切酶與CRISPR核酸酶蛋白進行融合，并引入了核定位信號（NLS）序列以構(gòu)建表達載體，用于基因編輯。綜上所述，T5核酸外切酶在基因編輯中的應(yīng)用可以增強編輯效率和效果，尤其是在與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合使用時。Endo H 是一種糖蛋白特異性的酶，主要作用于含有 N - 連接寡糖鏈的糖蛋白，對其他類型的生物大分子如核酸。Recombinant Human PDGF-BB Protein

T4 DNA 聚合酶是一種模板依賴的 DNA 聚合酶，需要特定的 DNA 模板才能進行 DNA 合成反應(yīng)。PreScission Protease(PSP) 重組PreScission蛋白酶

耐高鹽全能核酸酶與一般核酸酶的主要區(qū)別體現(xiàn)在以下幾個方面：1.**鹽耐受性**：-**耐高鹽全能核酸酶**：具有較高鹽濃度耐受性，在150-900mM鹽濃度范圍內(nèi)有效，尤其在600-700mM鹽濃度下活性比較好。-**一般核酸酶**：大多數(shù)全能核酸酶在高鹽環(huán)境下會失活，酶切效果降低。2.**活性條件**：-**耐高鹽全能核酸酶**：在0.5MNaCl條件下具有比較好活性，這使得它在高鹽環(huán)境下也能保持高效。-**一般核酸酶**：可能在低鹽或無鹽條件下活性更高，但在高鹽條件下活性受限。3.**應(yīng)用領(lǐng)域**：-**耐高鹽全能核酸酶**：廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)工藝流程中高鹽環(huán)境下核酸污染去除，如病毒純化、疫苗生產(chǎn)、蛋白和多糖類制藥工業(yè)等。-**一般核酸酶**：可能更多用于一般的分子生物學(xué)實驗，如DNA或RNA的降解，但不特別針對高鹽環(huán)境。4.**酶切效果**：-**耐高鹽全能核酸酶**：能夠有效去除核酸殘留，將所有類型的DNA和RNA降解為3~5個堿基片段。-**一般核酸酶**：酶切效果可能受到高鹽環(huán)境的影響，導(dǎo)致效率降低。5.**pH范圍**：-**耐高鹽全能核酸酶**：具有寬泛的pH范圍(7.0-11.0)，在這一范圍內(nèi)保持活性。-**一般核酸酶**：可能具有更窄的pH活性范圍。PreScission Protease(PSP) 重組PreScission蛋白酶