逆轉錄實驗步驟：引物濃度計算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為XuM（pmol/ul）加DEPC水體積（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）。用AMV逆轉錄酶進行RT（10ul體積）1、準備0.65mlEP管。2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA。3、稍離心，100℃沸水裕1min。4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆轉錄酶。5、稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT。6、100℃沸水裕3min滅活AMV。7、立即PCR或－20℃保存。逆轉錄實驗時注意事項：為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。逆轉錄實驗過程中避免光照，防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。廣州快速反轉錄企業

多逆轉錄酶都具有多種酶活性，DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的首先條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些反轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。反轉錄酶的發現對于遺傳工程技術起了很大的推動作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA并以它為模板，在反轉錄酶的作用下，合成出互補的DNA(cDNA)，由此可構建出cDNA文庫(cDNalibrary)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術中較常用的獲得目的基因的方法。蘇州cDNA合成反轉錄供貨商逆轉錄PCR反應過程中要注意反應管中溶液面積不宜過高，避免泡沫問題。

逆轉錄常見問題及解決方法之RNA濃度不高：a)、原始組織樣本或細胞量太少:提高加入量。b)、RNA發生降解:如果使用者確定提取RNA的試劑/器具沒有問題，RNA的降解通常發生在樣品破碎/勻漿階段。有兩個辦法可以徹底抑制內源RNase活性:1.立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。這只適合培養細胞及內源RNase含量較低的并且較容易勻漿的組織，2.對于內源RNase含量高或不易勻漿的組織，如肝臟、胰腺、脾臟、肌肉等，或植物組織，需要切成小塊后立即投入液氮冷凍，再按說明進行破碎/勻漿。c)、加入異丙醇后室溫沉淀10min或-20C冰沉淀30min即可，無需過夜沉淀。

反轉錄酶(reversetranscriptase,也可寫成逆轉錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致死RNA病毒中發現了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為模板，以dNTP為底物，tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物，在tRNA3'-OH末端上，根據堿基配對的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA，CDNA)。反轉錄酶（Reversetranscriptase）是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉錄酶和鼠類B型病毒的反轉錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉錄酶則由兩上亞基結構。真核生物中也都分離出具有不同結構的反轉錄酶。逆轉錄過程的揭示是分子生物學研究中的重大發現，是對中心法則的重要修正和補充。

反轉錄酶的選擇：反轉錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉錄酶。是以RNA為模板指導dNTP合成互補DNA（cDNA）的酶。一部分反轉錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶和禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶。依據RT-PCR，理想的狀態下是選擇具有較高熱穩定性的反轉錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進行，確保成功轉錄具有較高二級結構的RNA，并確保在整個反應過程中的全部活性，從而得到質量更高的cDNA。逆轉錄過程由逆轉錄酶催化，此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶，即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。上海miQP2反轉錄公司

逆轉錄酶通常具有多種活性，如逆轉錄活性、復制活性與RNA酶H活性。廣州快速反轉錄企業

逆轉錄引物：加尾法逆轉錄引物的結構并不是想象中那么簡單的oligodT，其包含三個關鍵結構：①為了與PolyA序列互補配對，OligodT序列必不可少。②在OligodT序列的5端，存在一段通用序列，用于qPCR過程中反向引物與cDNA的結合。③OligodT序列的3端存在一個或兩個錨定堿基，V或者VN。(兼并堿基，V表示A、G或C，N表示ATCG中的任意一種)。如果沒有錨定堿基，逆轉錄引物中的OligodT就會隨機結合到PolyA的任意位置，這樣會造成同一miRNA的逆轉錄產物長度不一，給較后的熔解曲線檢測帶來麻煩。因此，錨定堿基的作用就是特異性地結合到miRNA上，從而讓逆轉錄引物結合到緊挨著miRNA的那段PolyA序列上。只有這樣，才能夠保證同一miRNA的逆轉錄產物大小相同。廣州快速反轉錄企業

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