什么是RNA提取?RNA提取是指從樣品中純化RNA的過程。RNA提取的常規方法稱為硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取。Guanidiniumthiocyanate使蛋白質變性。此外,它破壞水分子的氫鍵并用作離液劑。RNA提取中使用一種特殊試劑,稱為三試劑。它含有硫氰酸胍、苯酚和乙酸鈉。RNA提取的基本步驟的目的與DNA提取的目的相似。1.用冰冷的PBS洗滌細胞以維持細胞的滲透壓。2.吸出細胞并用Tri-reagent勻漿樣品。3.加入氯仿并搖勻。4.離心可能會出現三層。頂層是透明的水層。中間層或界面包含沉淀的DNA。底層是有機層,呈粉紅色。5.除去水層并加入異丙醇。離心可能會產生沉淀。6.用75%乙醇清洗沉淀。空氣干燥顆粒。7.用TE緩沖液或水溶解沉淀。DNA提取需要選擇適當的樣品,如血液、組織、唾液等。南京細胞DNA提取可測序
血清血漿MicroRNA提取:取出析出液和洗滌液,按以下操作:a)析出液:4.5mL加入25.5mL無水乙醇;9mL加入51mL無水乙醇。b)洗滌液:9mL加入21mL無水乙醇;18mL加入42mL無水乙醇。c)配制好的析出液及洗滌液如出現沉淀,可在37℃溶解,搖勻后使用。取2.0mL離心管1支,依次加入1mL血清/血漿樣本、100μL溶液E、700μL溶液Q,上下顛倒混勻,室溫/4℃靜置20分鐘。12,000rpm4℃離心5分鐘,棄上清,收集離心管內沉淀。向沉淀中依次加入200μL裂解液、4μLRNACarrier、及20μL消化液,漩渦震蕩至沉淀完全分散,56℃水浴10分鐘。加入500μL析出液,輕輕顛倒混勻,如有半透明懸浮物,不影響RNA的提取與后續實驗。將吸附柱放入收集管內,將上述溶液轉入吸附柱內,靜置2min,12,000rpm4℃離心1min,棄收集管內廢液。南京細胞DNA提取純度高DNA提取的樣品準備之生物組織:較好新鮮組織,若不能馬上提取,應貯存-70℃或液氮。
磁珠法提取DNA提取方法:實驗步驟,磁珠法核酸提取一般可以分為四步:裂解——結合——洗滌——洗脫。裂解:核酸必須從細胞或其他生物物質中釋放出來,細胞裂解可通過機械作用、化學作用、酶作用等方法實現。其中,酶作用主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈霉蛋白酶)以使細胞破裂,核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質,促進核酸的分離。結合:磁珠表面帶負電荷,磁珠buffer是高鹽環境有帶正電荷的鹽離子,樣本被buffer影響,磷酸基團帶負電荷。
血清血漿MicroRNA提取:將吸附柱放回收集管內,加500μL洗滌液至吸附柱內,12,000rpm4℃離心1min,棄收集管內廢液。將吸附柱放回收集管內,12,000rpm4℃離心2min,離去殘留的洗滌液。取出吸附柱,放入新的1.5mL離心管內,加入30-50μL洗脫液,靜置3min,12,000rpm4℃離心2min,收集RNA溶液。提取的RNA即可用于下一步實驗或-20℃保存。血清血漿MicroRNA提取的注意事項:裂解液、洗滌液含有刺激性化學物質,操作過程請做好防護措施,避免直接接觸皮膚,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮膚或眼睛,請立即用清水或生理鹽水沖洗,必要時請就醫。消化液、RNACarrier請于-20℃存放,避免反復凍融。DNA提取需要通過加入濃鹽然后離心分離細胞碎片、消化蛋白質、脂質和RNA。
DNA提取檢測:溴乙錠染色:在254nm紫外光下檢測,如需回收較好在300nm紫外光下割膠。銀染法:Ag+與DNA形成復合物,在甲醛還原下可染成黑褐色,靈敏度高200倍,但不能回收。DNA提取回收:電泳到DEAE-纖維素膜:在所需條帶前插入DEAE-纖維素膜,繼續電泳至條帶DNA都到膜上,取出洗下。透析袋電洗脫:切下條帶的瓊脂糖放透析袋內,加緩沖液后繼續電泳,DNA出膠后回收。低熔點瓊脂糖凝膠:切下膠,加熱熔化膠,然后用酚抽提回收DNA。DNA提取后可以用于PCR擴增、測序、基因編輯等多種應用。南京細胞DNA提取純度高
RNA提取可以用于研究不同類型的RNA,例如mRNA、rRNA或miRNA。南京細胞DNA提取可測序
外泌體DNA提取過程:1、將吸附柱放入收集管內,將700μL上述溶液轉入吸附柱內,12,000rpm4℃離心1分鐘,棄收集管內廢液;將剩余溶液轉移至吸附柱內,12,000rpm4℃離心1分鐘,棄收集管內廢液。2、將吸附柱放回收集管內,加500μL洗滌液A至吸附柱內,靜置2分鐘,12,000rpm4℃離心1分鐘,棄收集管內廢液。3、將吸附柱放回收集管內,加500μL洗滌液B至吸附柱內,12,000rpm4℃離心1分鐘,棄收集管內廢液。4、按每份樣本40μL取洗脫液(如10份提取樣本,即取400μL洗脫液),放置于滅菌1.5mL離心管,65℃預熱。5、將吸附柱放回收集管內,12,000rpm4℃離心2分鐘,離去殘留的洗滌液。6、取出吸附柱,放入新的1.5mL離心管內,加入上述預熱的40μL洗脫液,靜置3分鐘,12,000rpm4℃離心1分鐘,收集DNA溶液。7、-20℃保存,或直接用于下一步實驗。南京細胞DNA提取可測序
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