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深圳快速逆轉錄混合測序

來源: 發布時間:2023-06-15

逆轉錄PCR的用途普遍,可用于分析基因的轉錄產物、檢測細胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、病癥檢測、檢測病人標本中的RNA病毒,如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環境脅迫對植物基因表達的影響,以及在特定的環境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用RT-PCR檢測分析RNA轉錄產物具有以下突出的優點:理論上可以檢測幾乎任何基因的轉錄產物;可以實現極為微量RNA樣品(ng級別)的檢測;樣品耐受性好,未經純化的粗制生物樣品也可以用于檢測。逆轉錄實驗要使用高質量的反轉錄酶和逆轉錄引物,避免引物交叉污染。深圳快速逆轉錄混合測序

miRNA的加尾法逆轉錄和qPCR,miRNA加尾法逆轉錄:增加miRNA逆轉錄產物長度較直接的方法就是增加miRNA的長度,即在miRNA的3端后面添加一段序列,然后進行逆轉錄反應。因此,加尾法是由兩個酶共同作用完成的,它們分別是PolyA聚合酶和逆轉錄酶。PolyA聚合酶負責給miRNA加上PolyA尾,增加其長度。之后逆轉錄引物結合到PolyA序列上,由逆轉錄酶完成加長版cDNA的合成。miRNA的加尾法逆轉錄和qPCR中的qPCR:miRNA熒光定量PCR的過程跟普通mRNA的相似,但由于加尾法逆轉錄產物的5端均為通用序列,因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R),不同的是根據miRNA序列設計的正向引物。正向引物的特異性就變得非常重要。對于內參,生工生物的miRNA加尾法首先鏈cDNA合成試劑盒(B532451)中內置了內參U6的正向引物,使用該引物與通用引物R即可進行內參U6的擴增。深圳快速逆轉錄混合測序逆轉錄實驗過程需適當的RNA質量,過少或質量不佳將影響擴增效果。

反轉錄酶的用處:由它催化轉錄合成的DNA稱為互補DNA(cDNA)。通常情況下,細胞內的轉錄應由DNA到RNA的,所得RNA為信使RNA(mRNA)供蛋白質合成作模板用。而在部分RNA病毒中,要實現自身擴增,必須具有DNA,因此先由RNA逆轉錄合成cDNA再由cDNA轉錄出RNA。逆轉錄酶可用RT—PCR,將RNA轉變為DNA后擴增,以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發現了反轉錄酶,并認為此酶與病毒的致死性質有關。反轉錄酶也分布于某些正常細胞和胚胎細胞。反轉錄酶的發現表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質非常化,遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究,已成為研究這些學科的有力工具。

逆轉錄的發現有重要的理論意義和實踐意義。(1)在致死病毒的研究中發現了病基因,在人類一些病細胞如膀胱病、小細胞肺病等細胞中,也分離出與病毒病基因相同的堿基序列,稱為細胞病基因或原病基因。病基因的發現為疙瘩發病機理的研究提供了很有前途的線索。(2)在實際工作中有助于基因工程的實施。由于目的基因的轉錄產物易于制備,可將mRNA反向轉錄形成DNA用以獲得目的基因。逆轉錄酶實驗操作注意事項:RNA提取一定要迅速,樣本要新鮮,組織盡量在液氮中研磨;RNA提取完馬上進行逆轉錄不要拖延,新提的RNA很容易降解;逆轉錄反應過程,需建立無RNAase環境,以避免模板RNA降解。RNase是RNA水解酶的統稱,包含RNaseA,RNaseH等,RNaseA可以水解單雙鏈RNA,RNaseH主要水解RNA與DNA雜交雙鏈中的RNA。逆轉錄的目的是將RNA變為DNA,便于PCR擴增。

M-MLV反轉錄酶比AMV反轉錄酶缺乏連續性,因此要獲得像AMV反轉錄酶反應中產生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉錄酶。用1微克的mRNA起始合成首先條鏈的cDNA,要用8單位的M-MLV反轉錄酶才相當于1單位的AMV反轉錄酶的作用。該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制,該酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反轉錄酶5X反應緩沖液,也不能用Promega的RiboclonecDNA首先條鏈緩沖液,因為這二種緩沖液均含有亞精胺。逆轉錄實驗可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染,逆轉錄實驗過程需適當的RNA質量,過少或質量不佳將影響擴增效果。逆轉錄技術的發展使RNA研究得到極大便利。西安帶gDNA Remover反轉錄

逆轉錄實驗過程中要使用干燥無菌的管頭和標本采集器避免受外界污染。深圳快速逆轉錄混合測序

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