逆轉(zhuǎn)錄常見問題及解決方法之組織提?。篟NAisolater可以提取miRNA嗎?可以提取miRNA。他普遍適用于培養(yǎng)細(xì)胞、動物組織、微生物以及代謝較少的植物組織，如幼苗、幼葉等。提取的RNA有基因組DNA污染：a)、向裂解液中加入氯仿后，需要在低溫下(2-8°C)高速離心。離心后，RNA被抽提到上層的水相中，中、下層是有機(jī)相，含有氯仿。DNA即存在于中層。氯仿在常溫下會與水以一定比例互溶，因此，常溫離心會導(dǎo)致上層水相中也有少量基因組DNA污染。吸取上層液體時(shí)，應(yīng)非常小心，避免吸到中間層和下層，為此失去一點(diǎn)得率，保留一些上清不吸是非常值得的。RNA應(yīng)如何保存：建議分裝后在-80℃長期保存，在-20℃可以短期保存，但需要盡快使用。逆轉(zhuǎn)錄過程的揭示是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)，是對中心法則的重要修正和補(bǔ)充。重慶加尾法反轉(zhuǎn)錄企業(yè)

逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。此過程中，核酸合成與轉(zhuǎn)錄（DNA到RNA）過程與遺傳信息的流動方向（RNA到DNA）相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格意義上來說沒有什么區(qū)別，但是逆轉(zhuǎn)錄是某些病毒的自主行為，如逆轉(zhuǎn)錄病毒，它們在整合到宿主細(xì)胞內(nèi)前以RNA為模板形成DNA的過程；反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過程中，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過程。二者雖同為RNA→DNA的過程，但地點(diǎn)不同，相對性的來說，逆轉(zhuǎn)錄在體內(nèi)，反轉(zhuǎn)錄在體外。重慶一步法逆轉(zhuǎn)錄酶純度高逆轉(zhuǎn)錄可改變RNA的信息內(nèi)容，為研究RNA功能提供基礎(chǔ)。

逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來，可用于合成首先鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉(zhuǎn)錄、測序和RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本酶是通過點(diǎn)突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同，同時(shí)其延伸能力也有明顯提高。逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）一個(gè)活性單位定義為在37℃，10min條件下，使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉淀物質(zhì)所需的酶量。逆轉(zhuǎn)錄酶的三個(gè)功能：1、RNA為模板指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；2、DNA為模板指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；3、RNaseh活性。

反轉(zhuǎn)錄酶的用處：由它催化轉(zhuǎn)錄合成的DNA稱為互補(bǔ)DNA(cDNA)。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)由DNA到RNA的，所得RNA為信使RNA（mRNA）供蛋白質(zhì)合成作模板用。而在部分RNA病毒中，要實(shí)現(xiàn)自身擴(kuò)增，必須具有DNA，因此先由RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA再由cDNA轉(zhuǎn)錄出RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶可用RT—PCR，將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA后擴(kuò)增，以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，并認(rèn)為此酶與病毒的致死性質(zhì)有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶也分布于某些正常細(xì)胞和胚胎細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質(zhì)非?；?，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進(jìn)了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，已成為研究這些學(xué)科的有力工具。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)前應(yīng)將各反應(yīng)試劑混勻，避免試劑沉淀或剪切。

RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：去除基因組DNA污染：殘留的基因組DNA(gDNA)會對熒光定量結(jié)果造成很大的干擾，為了使結(jié)果更加的真實(shí)、可重復(fù)，我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設(shè)計(jì)時(shí)避免gDNA的擴(kuò)增，比如將上下游引物分別設(shè)在不同的外顯子上；或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后，我們還有非常法寶，選擇一款具有g(shù)DNA去除功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性：逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少RNA的二級結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。野生型的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶很“怕熱”，高于37℃時(shí)，穩(wěn)定性大幅下降。逆轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。重慶一步法逆轉(zhuǎn)錄酶純度高

HIV病毒復(fù)制的一個(gè)重要步驟就是逆轉(zhuǎn)錄。重慶加尾法反轉(zhuǎn)錄企業(yè)

逆轉(zhuǎn)錄酶是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶。RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下二種活性：依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA的首先條鏈。依賴DNA的DNA聚合酶活性：以一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈DNA。在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時(shí)，建議選擇無RNaseH①活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性會與聚合酶活性競爭RNA模板與DNA引物（或cDNA延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量與長度。重慶加尾法反轉(zhuǎn)錄企業(yè)

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