差速離心法分離外泌體的實驗原理：外泌體是一種小的(40-100nm)細(xì)胞外膜囊泡，目前進(jìn)行外泌體分離的普遍方法是差速離心法。應(yīng)用差速離心法和粒徑分析等是細(xì)胞外囊泡(EV)研究的重要步驟。已知細(xì)胞會分泌許多膜囊泡，這些囊泡的大小、分子含量及其形成機(jī)制各不相同具體取決于細(xì)胞的類型和當(dāng)前狀態(tài)。通常可以辨別出三個主要的EV群體：凋亡小體、脫落的囊泡和外泌體.凋亡小體是已知較大的囊泡，直徑為800-5000nm，由凋亡后細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜成分組成。脫落的囊泡和外泌體由非凋亡細(xì)胞釋放。脫落的囊泡，也稱為“胞外體”或有時稱為“微泡”，是由質(zhì)膜起泡產(chǎn)生的，一般的粒徑尺寸范圍為(50–1000nm)。外泌體來源于細(xì)胞內(nèi)各種類型的囊泡，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞膜等。快速提取外泌體RT-qPCR

外泌體的提取主要包括以下幾種方式。一是免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步的實驗。二是PS親和法，該方法將PS（磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度較高。由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。2016.9《ScientificReports》雜志發(fā)表了該方法較新數(shù)據(jù)，表明PS法可提取相當(dāng)高純度的外泌體。長沙血液外泌體多少錢優(yōu)化外泌體分離方法可以用于解決外泌體復(fù)雜性掩蓋的問題。

外泌體分離方法之沉淀分離方法：：基于聚合物的沉淀分離方法是利用超親水聚合物來增強(qiáng)小尺寸顆粒（如外泌體）的沉淀。聚乙二醇的常用濃度在8%到15%之間變化。使用這種方法，將含有外泌體的溶液與聚合物一起孵育過夜，并在約10,000×g下進(jìn)一步離心。外泌體分離方法之FFF分離法：FFF目前是一種很少使用但前景不錯的一種外泌體分離方法。分離由橫流力驅(qū)動，并基于顆粒的分子量或流體動力學(xué)直徑。它包括高純度、高效率和短時間處理，但迄今為止，F(xiàn)FF在外泌體分離中的使用案例較少，還有待進(jìn)一步開發(fā)。

外泌體分離方法之過濾法：超濾膜也可用于外泌體的分離。根據(jù)微泡的大小，使用超濾膜過濾的方法可以將外泌體與蛋白質(zhì)和其他大分子分離。外泌體也可以通過多孔結(jié)構(gòu)捕獲它們來分離。常見的過濾膜孔徑為0.8m、0.45m或0.22m，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌體。比如微柱多孔硅纖毛結(jié)構(gòu)一般用于分離40-100nm外泌體。在初始步驟中，去除較大的囊泡。在接下來的步驟中，外泌體會群集中在過濾膜上。隔離步驟相對較短，但該方法需要用PBS緩沖液對硅結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)孵育。除標(biāo)準(zhǔn)過濾技術(shù)外，切向流過濾在有效分離外泌體方面也有著嘗試應(yīng)用，通過切向流過濾技術(shù)去除游離肽和其他小化合物從而分離具有確定大小的外泌體。此外，在體外研究和脂肪組織中，也會采用超濾與SEC的結(jié)合的方式來分離外泌體。通過(a)對片上過濾器施加壓力或(b)產(chǎn)生電場，迫使外泌體穿過多孔膜，結(jié)合錯流和電泳分選來完成篩分。分離過程中避免對外泌體結(jié)構(gòu)和功能造成影響至關(guān)重要。

外泌體是直徑為30-150nm的小細(xì)胞外囊泡。在生理和病理條件下，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以釋放外泌體，在細(xì)胞通訊和表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用。外泌體天然存在于體液中，包括血液，唾液，尿液和腦脊液等，內(nèi)部含有其來源細(xì)胞的核酸，蛋白等物質(zhì)，因此基于外泌體的疾病診斷和治著方法得到了深入的研究。但是如何拿到純凈的外泌體一直是外泌體研究所面臨的難題之一，因此研究人員也開發(fā)了許多外泌體分離的方法，來一起看一下吧。差速離心法：離心力從300×g到100,000×g的下進(jìn)行多次循環(huán)離心，較后收集外泌體顆粒。密度梯度離心法：等密度梯度超速離心法是通過從下到上逐步降低密度分層。動區(qū)梯度超速離心法由兩個梯度介質(zhì)部分組成，樣品根據(jù)密度/質(zhì)量/大小被依次分離。外泌體的高純度分離是外泌體研究的基礎(chǔ)。長沙血液外泌體多少錢

外泌體分離方法的優(yōu)化需要對比不同方法的純度和收率。快速提取外泌體RT-qPCR

外泌體分離方法優(yōu)缺點對比：差速離心法：差速離心法仍是實驗中常用的外泌體分離技術(shù)。主要步驟如下：1.使用離心機(jī)低速離心來去除細(xì)胞與細(xì)胞碎片。2.而后增加轉(zhuǎn)速通過離心來消除樣本中較大的細(xì)胞囊泡。3.再使用高速離心機(jī)進(jìn)行高速離心，通過離心沉淀的方式提取外泌體。在這里，需要注意的是生物流體的粘度與分離的外泌體的純度有較強(qiáng)的相關(guān)性。所以，對于高粘度的生物樣品需要超速離心機(jī)進(jìn)行較長時間的離心操作。外泌體分離方法之免疫分離法：免疫芯片方法基于表面外泌體受體，用于根據(jù)來源分離外泌體。獲得的外泌體可直接分析或用于DNA或總RNA分離。外泌體胞內(nèi)蛋白可用作分離外泌體的特異性標(biāo)志物。此外，基于ELISA的ExoTEST也可以用于有效分離外泌體。其原理是：使用涂有外泌體抗體的ExoTEST板，可以從各種生物體液中分離出外泌體。該方法適用于常見和細(xì)胞類型特異性外泌體蛋白的檢測、分析和定量。快速提取外泌體RT-qPCR

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