反轉錄酶(reversetranscriptase,也可寫成逆轉錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致死RNA病毒中發現了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為模板，以dNTP為底物，tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物，在tRNA3'-OH末端上，根據堿基配對的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA，CDNA)。反轉錄酶（Reversetranscriptase）是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉錄酶和鼠類B型病毒的反轉錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉錄酶則由兩上亞基結構。真核生物中也都分離出具有不同結構的反轉錄酶。逆轉錄的目的是將RNA變為DNA，便于PCR擴增。cDNA合成逆轉錄混合蛋白質提取

反轉錄酶的選擇：反轉錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉錄酶。是以RNA為模板指導dNTP合成互補DNA（cDNA）的酶。一部分反轉錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶和禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶。依據RT-PCR，理想的狀態下是選擇具有較高熱穩定性的反轉錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進行，確保成功轉錄具有較高二級結構的RNA，并確保在整個反應過程中的全部活性，從而得到質量更高的cDNA。cDNA合成逆轉錄混合蛋白質提取逆轉錄實驗在反應前應將各反應試劑混勻，避免試劑沉淀或剪切。

逆轉錄PCR的用途普遍，可用于分析基因的轉錄產物、檢測細胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、病癥檢測、檢測病人標本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環境脅迫對植物基因表達的影響，以及在特定的環境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用RT-PCR檢測分析RNA轉錄產物具有以下突出的優點：理論上可以檢測幾乎任何基因的轉錄產物；可以實現極為微量RNA樣品（ng級別）的檢測；樣品耐受性好，未經純化的粗制生物樣品也可以用于檢測。

逆轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。逆轉錄酶的發現對于遺傳工程技術起了很大的推動作用，它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA并以它為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，由此可構建出cDNA文庫（cDNAlibrary），從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術中較常用的獲得目的基因的方法。簡要過程表示：逆轉錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一條與RNA模板互補的cDNA單鏈，它與RNA模板形成RNA-cDNA雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成過程。病毒復制方式：逆轉錄病毒（屬于RNA病毒）：RNA→DNA→RNA。擬逆轉錄病毒（屬于DNA病毒）：DNA→RNA→DNA。逆轉錄在病毒學、免疫學等領域有普遍的應用。

逆轉錄實驗的準備工作：1、實驗器具與材料：（1）移液頭：200ul、10ul；（2）吸頭：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、實驗器具的處理與準備，塑料制品：（包括吸頭、EP管等）將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小頭頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將頭頭放入吸頭臺。3、試劑配制和準備：（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓，后分裝到幾個1。5mlEP管中，-20℃中保存備用。（2）RT中所需要的各種試劑。逆轉錄經常與細胞惡性轉化有關，艾滋、乙肝等很多疾病也有逆轉錄過程。cDNA合成逆轉錄混合蛋白質提取

逆轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。cDNA合成逆轉錄混合蛋白質提取

RT-PCR逆轉錄引物設計原則：1.上下游引物要保守：擴增子長度需選擇一段保守片段（100-200bp）進行PCR擴增，選擇片段需跨越內含子，因內含子的基因組DNA序列不會被擴增，也可減少從污染的基因組DNA中擴增得到的假陽性風險。引物選取同樣需要保守。2.引物長度和Tm值：引物設計長度為18-25bp，Tm值在50-65℃之間，引物中GC含量在40-60%。設計引物時盡量避免出現4個或超過4個G堿基。RT-PCR實驗陰性對照：反轉錄陰性對照應包括在所有的RT-PCR的實驗中，用來檢測DNA是否污染（如基因組DNA或PCR產物）。該對照所指不加反轉錄酶，通過反轉錄過程得到cDNA在進行熒光定量PCR檢測。如檢測到擴增，則樣本中可能含有基因組DNA污染。cDNA合成逆轉錄混合蛋白質提取

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