逆轉錄PCR的用途普遍,可用于分析基因的轉錄產物、檢測細胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、病癥檢測、檢測病人標本中的RNA病毒,如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環境脅迫對植物基因表達的影響,以及在特定的環境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用RT-PCR檢測分析RNA轉錄產物具有以下突出的優點:理論上可以檢測幾乎任何基因的轉錄產物;可以實現極為微量RNA樣品(ng級別)的檢測;樣品耐受性好,未經純化的粗制生物樣品也可以用于檢測。逆轉錄后的DNA可直接用于基因克隆或測序等應用。重慶miQP2逆轉錄報價
逆轉錄的端粒復制:對于線性基因組,其滯后鏈的末端是無法完整復制的,每次約損失30-200個核苷酸(Cells.2020Feb22;9(2).)。這樣隨著細胞分裂,端粒會持續縮短,造成復制性衰老。對于大多數體細胞來說,端粒磨損是一種控制其分裂潛力的機制,但對于需要多次增殖的干細胞來說,必須設法維持端粒長度。端粒酶(telomerase)可以通過逆轉錄過程延長端粒。端粒酶由端粒酶RNA(TERC)和端粒酶逆轉錄酶(TERT)組成。TERT使用TERC作為模板,在染色體的單鏈末端合成端粒DNA的重復序列。大多數體細胞缺乏端粒酶活性,因而容易衰老。但未分化的生殖細胞,干細胞,活化的淋巴細胞和大多數疙瘩細胞具有高水平的端粒酶活性,可以克服端粒磨損并維持無限的細胞分裂。北京彩色逆轉錄試劑公司逆轉錄經常與細胞惡性轉化有關,艾滋、乙肝等很多疾病也有逆轉錄過程。
逆轉錄酶(M-MLV)從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來,可用于合成首先鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉錄、測序和RNA的逆轉錄反應。本酶是通過點突變使RNaseH活性缺失,所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同,同時其延伸能力也有明顯提高。逆轉錄酶(M-MLV)一個活性單位定義為在37℃,10min條件下,使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉淀物質所需的酶量。逆轉錄酶的三個功能:1、RNA為模板指導的DNA聚合酶活性;2、DNA為模板指導的DNA聚合酶活性;3、RNaseh活性。
miRNA加尾法逆轉錄:miRNA,即microRNA,是一類非常短的RNA分子,只有幾十到幾百個核首酸,在正常細胞存活期間會產生大量的miRNA。miRNA起著重要的抑制作用,它可以抑制特定mRNA的表達以及細胞中內含物翻譯和轉錄等功能他們是催化機制,負責影響細胞及其產物的生物學復雜性和穩定性,對于宿主機體影響是非常重要的。miRNA加尾法是一種獲得miRNA及其前體的研究方法之。較重要的是,它是RNA千擾技術的一個重要組成部分。過去的研究發現,通過miRNA加尾法獲得的新miRNA表達調節了細胞信號傳導、細胞分裂和細胞凋亡等多重信號傳遞通路,其過程非常復雜。逆轉錄實驗中的RNA樣品處理時要避免使用酸性物質、有機溶劑和酶切酶劑。
逆轉錄常見問題及解決方法之RNA濃度不高:a)、原始組織樣本或細胞量太少:提高加入量。b)、RNA發生降解:如果使用者確定提取RNA的試劑/器具沒有問題,RNA的降解通常發生在樣品破碎/勻漿階段。有兩個辦法可以徹底抑制內源RNase活性:1.立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。這只適合培養細胞及內源RNase含量較低的并且較容易勻漿的組織,2.對于內源RNase含量高或不易勻漿的組織,如肝臟、胰腺、脾臟、肌肉等,或植物組織,需要切成小塊后立即投入液氮冷凍,再按說明進行破碎/勻漿。c)、加入異丙醇后室溫沉淀10min或-20C冰沉淀30min即可,無需過夜沉淀。逆轉錄實驗可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染。武漢一步法逆轉錄報價
逆轉錄是以RNA為模板合成DNA的過程,即RNA指導下的DNA合成。重慶miQP2逆轉錄報價
逆轉錄(reversetranscription)是以RNA為模板合成DNA的過程,即RNA指導下的DNA合成。此過程中,核酸合成與轉錄(DNA到RNA)過程與遺傳信息的流動方向(RNA到DNA)相反,故稱為逆轉錄。逆轉錄與反轉錄嚴格意義上來說沒有什么區別,但是逆轉錄是某些病毒的自主行為,如逆轉錄病毒,它們在整合到宿主細胞內前以RNA為模板形成DNA的過程;反轉錄是進行基因工程過程中,人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA,并以之為模板人工合成DNA的過程。二者雖同為RNA→DNA的過程,但地點不同,相對性的來說,逆轉錄在體內,反轉錄在體外。重慶miQP2逆轉錄報價