反轉錄酶的選擇：反轉錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉錄酶。是以RNA為模板指導dNTP合成互補DNA（cDNA）的酶。一部分反轉錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶和禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶。依據RT-PCR，理想的狀態下是選擇具有較高熱穩定性的反轉錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進行，確保成功轉錄具有較高二級結構的RNA，并確保在整個反應過程中的全部活性，從而得到質量更高的cDNA。逆轉錄實驗時要記錄反應體系的溫度、時間、反應試劑的添加量等參數。成都莖環法反轉錄

人體中也有逆轉錄過程，比如端粒的復制。端粒（telomere）是染色體末端的特殊結構，由重復的DNA序列（TTAGGG）和核的蛋白組成，可以保護染色體末端，維持基因組完整性。端粒的末端是單鏈3'末端，形成一種緊湊的T環結構，可保持其穩定性。其表面覆蓋著Shelterin復合物，包括TRF1（端粒重復結合因子1）、TRF2（端粒重復結合因子2）、TIN2（TRF1相互作用核的蛋白2）、RAP1（rif相關蛋白）、POT1（端粒保護）和TPP1（端粒保護蛋白1）成功將人表皮干細胞體外分離培養的基礎上，對比觀察不同發育階段人表皮干細胞端粒酶反轉錄酶表達的差異特征，結果表明人胚胎、少兒、成人皮膚來源的表皮干細胞均有端粒酶反轉錄酶表達，其表達強度依次減弱。提示誘導和增強端粒酶反轉錄酶的表達對維持表皮干細胞在體外自我更新和增殖能力可能具有重要意義。上海莖環法逆轉錄哪家好逆轉錄技術應用于人類基因組的研究。

逆轉錄過程由逆轉錄酶催化，此酶也稱依賴RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA為模板催化DNA鏈的合成。合成的DNA鏈稱為與RNA互補DNA（complementaryDNA,cDNA）。逆轉錄酶在生物界存在于逆轉錄病毒以及真核細胞（如端粒酶）中，擬逆轉錄病毒沒有單獨的逆轉錄酶，其DNA聚合酶帶有逆轉錄酶的活性，可能與病毒的惡性轉化有關。人類免疫缺陷病毒（HIV）就是一種逆轉錄病毒，含有逆轉錄酶。在小鼠及人的正常細胞和胚胎細胞中也有逆轉錄酶，例如端粒酶就是一種逆轉錄酶，推測可能與細胞分化和胚胎發育有關。

逆轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。逆轉錄酶的發現對于遺傳工程技術起了很大的推動作用，它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA并以它為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，由此可構建出cDNA文庫（cDNAlibrary），從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術中較常用的獲得目的基因的方法。簡要過程表示：逆轉錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一條與RNA模板互補的cDNA單鏈，它與RNA模板形成RNA-cDNA雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導的DNA合成過程。病毒復制方式：逆轉錄病毒（屬于RNA病毒）：RNA→DNA→RNA。擬逆轉錄病毒（屬于DNA病毒）：DNA→RNA→DNA。逆轉錄PCR反應過程中要注意反應管中溶液面積不宜過高，避免泡沫問題。

大多數逆轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為賴氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的首先條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。逆轉錄是2代測序、單細胞測序等技術的前置步驟。上海莖環法逆轉錄哪家好

逆轉錄過程中的缺陷會導致錯誤擴增和偏差。成都莖環法反轉錄

逆轉錄PCR的用途普遍，可用于分析基因的轉錄產物、檢測細胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、病癥檢測、檢測病人標本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環境脅迫對植物基因表達的影響，以及在特定的環境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用RT-PCR檢測分析RNA轉錄產物具有以下突出的優點：理論上可以檢測幾乎任何基因的轉錄產物；可以實現極為微量RNA樣品（ng級別）的檢測；樣品耐受性好，未經純化的粗制生物樣品也可以用于檢測。成都莖環法反轉錄