RNA逆轉錄實驗注意事項：防止RNA模板的降解：毫無疑問，RNA質量對cDNA合成結果會產生重要影響。但RNA很脆弱，易于降解。為了保證RNA的完整性，我們需要小心又小心，比如在冰上操作，用RNase-free的頭頭和離心管，減少操作時間等。在反應體系中加入RNase抑制劑也能有效防止RNA降解。另外，建議在進行逆轉錄前，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的質量。通常完整的真核RNA應包括28S、18S條帶，且28S條帶強度一般是18S的兩倍左右。RNA逆轉錄實驗注意事項：選擇合適的引物：OligodT引物和隨機引物都能進行逆轉錄。OligodT引物只能與mRNA的3’端poly(A)結合，沒有rRNA和tRNA的干擾，特異性強。逆轉錄實驗中的RNA樣品處理時要避免使用酸性物質、有機溶劑和酶切酶劑。武漢快速逆轉錄混合

逆轉錄的轉錄過程：基因的轉錄是由RNA聚合酶催化進行的。基因的上游具有結合RNA聚合酶的區域，叫作啟動子。啟動子是一段具有特定序列的DNA，具有和RNA聚合酶特異性結合的位點，決定了基因轉錄的起始位點。RNA聚合酶與啟動子結合后，在特定區域將DNA雙螺旋兩條鏈之間的氫鍵斷開，使DNA解旋，形成單鏈區，以非編碼鏈為模板合成RNA互補鏈的過程就開始了。轉錄的延長是以前面核苷酸的3′-OH為基礎逐個加入NTP，形成磷酸二酯鍵，使RNA逐步從5′向3′端延伸的過程。在原核生物中，因為沒有核膜的分隔，轉錄未完成即已開始翻譯，而且在同一個DNA模板上同時進行多個轉錄過程。電鏡下看到的羽毛狀圖形和羽毛上的小黑點（多聚核糖體），是轉錄和翻譯高效率的直觀表現。武漢快速逆轉錄混合逆轉錄實驗前要對反應體系進行無RNA和無反轉錄酶的對照。

反轉錄酶的注意事項，在進行RT反應之前，應考慮以下幾個方面：RNA：成功的cDNA合成來自高質量的RNA，高質量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中，要特別防止RNase的污染，同時在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在首先鏈cDNA合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑只防止RNaseA，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實驗過程中經常更換新手套。

逆轉錄酶（M-MLV）從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來，可用于合成首先鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉錄、測序和RNA的逆轉錄反應。本酶是通過點突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同，同時其延伸能力也有明顯提高。逆轉錄酶（M-MLV）一個活性單位定義為在37℃，10min條件下，使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉淀物質所需的酶量。逆轉錄酶的三個功能：1、RNA為模板指導的DNA聚合酶活性；2、DNA為模板指導的DNA聚合酶活性；3、RNaseh活性。逆轉錄過程的揭示是分子生物學研究中的重大發現，是對中心法則的重要修正和補充。

逆轉錄過程是病毒的復制形式之一，如RNA病毒中的逆轉錄病毒，DNA病毒中的擬逆轉錄病毒的復制均需要經過逆轉錄。逆轉錄過程在真核細胞中也同樣存在，例如逆轉座子和端粒DNA的延長均存在逆轉錄過程，需逆轉錄酶的催化，端粒酶即為真核細胞中的逆轉錄酶。逆轉錄過程的揭示是分子生物學研究中的重大發現，是對中心法則的重要修正和補充。人們通過體外模擬該過程，以樣本中提取的mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，構建cDNA文庫，并從中篩選特異的目的基因。該方法已成為基因工程技術中較常用的獲得目的基因的策略之一。逆轉錄實驗可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染。武漢快速逆轉錄混合

逆轉錄過程是病毒的復制形式之一，如RNA病毒中的逆轉錄病毒。武漢快速逆轉錄混合

RNA逆轉錄實驗注意事項：去除基因組DNA污染：殘留的基因組DNA(gDNA)會對熒光定量結果造成很大的干擾，為了使結果更加的真實、可重復，我們需要去除gDNA干擾。我們可以在引物設計時避免gDNA的擴增，比如將上下游引物分別設在不同的外顯子上；或者在提取RNA后使用DNaseI處理以除去gDNA。較后，我們還有非常法寶，選擇一款具有gDNA去除功能的逆轉錄試劑盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆轉錄實驗注意事項：逆轉錄酶熱穩定性：逆轉錄酶在整個反轉錄體系中具有關鍵性影響。除了活性以外，逆轉錄酶的熱穩定性同樣很重要，在較高溫度下進行逆轉錄，能夠減少RNA的二級結構，增加逆轉錄的效率。野生型的M-MLV逆轉錄酶很“怕熱”，高于37℃時，穩定性大幅下降。武漢快速逆轉錄混合