逆轉錄實驗過程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉錄酶的選擇，逆轉錄實驗前要對反應體系進行無RNA和無反轉錄酶的對照。多逆轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①RNA指導的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。逆轉錄可改變RNA的信息內容，為研究RNA功能提供基礎。蘇州cDNA合成逆轉錄制造商
逆轉錄酶的質量控制：1.切口酶：在與200單位酶37oC保溫60分鐘后，超螺旋質粒保留在90%以上。2.DNase測定：200單位酶與50ng3H-DNA37oC保溫60分鐘，分解出的放射性低于1%。3.RNase測定：200單位酶與50ng3H-RNA37oC保溫60分鐘，分解出的放射性低于3%。4.首先鏈cDNA的反應：在標準化的反應中，200單位酶催化從1mg1.2kbRNA或1mg7.5kbRNA將同位素摻入到cDNA中，通過放射自顯影，對于1.2kb的RNA，產物cDNA是單一的、全長的條帶。對于7.5kb的RNA產物有部分是全長的條帶。用這二種RNA放射性轉換到cDNA中有12%。5.RNaseH活性：200單位酶與polyA:polydT37oC保溫60分鐘，釋放出的放射性要低于1%。miQP2逆轉錄試劑生產商逆轉錄實驗時要記錄反應體系的溫度、時間、反應試劑的添加量等參數。
miRNA的加尾法逆轉錄和qPCR，miRNA與mRNA不同，成熟的miRNA的長度只有20nt左右，非常短，通常正向引物就足以覆蓋其全長甚至有余，反向引物就無處安放了。那么如何實現miRNA的qPCR擴增呢？解決方案就是在逆轉錄的時候設法增加逆轉錄產物長度。普遍的方法有兩種，加尾法和莖環法。經過加尾法或莖環法這種特殊的逆轉錄形式處理之后，得到的cDNA長度從原始的20nt增加到80nt以上，這樣就能夠實現miRNA的qPCR擴增了。RNA逆轉錄實驗注意事項：選擇合適的引物：但其對RNA的完整度和二級結構的要求較高，而且不適用于原核生物。隨機引物可以根據堿基情況結合到幾乎所有的RNA上，包括mRNA、tRNA和rRNA。
加尾法逆轉錄的較大特點在于：對于抽提純化的miRNA，進行無差別加尾。因此，如果用戶需要對樣本中的多個miRNA進行考察，一次逆轉錄即可完成對所有qPCR模板的制備。qPCR引物方面，miRNA以及內參的反向引物都是通用引物R，不同的只是正向引物。因此在設計加尾法miRNA的qPCR引物時，只需設計特異性正向引物即可，正向引物的特異性直接決定了實驗結果的好壞。總之，加尾法適合對樣本中多個miRNA的快速檢測。引物設計簡單，但有非特異性的風險。由于其特殊的加PolyA機制，因此miRNA加尾法逆轉錄是無法只通過常規的mRNA逆轉錄試劑盒完成的。逆轉錄實驗在反應前應將各反應試劑混勻，避免試劑沉淀或剪切。
反轉錄酶的選擇：反轉錄酶（Reversetranscriptase）又稱逆轉錄酶。是以RNA為模板指導dNTP合成互補DNA（cDNA）的酶。一部分反轉錄酶具有RNA酶活性，能夠在轉錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉錄酶沒有Rnase酶活性，可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶和禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶。依據RT-PCR，理想的狀態下是選擇具有較高熱穩定性的反轉錄酶，cDNA的合成才能在較高的溫度下進行，確保成功轉錄具有較高二級結構的RNA，并確保在整個反應過程中的全部活性，從而得到質量更高的cDNA。逆轉錄實驗過程中要使用干燥無菌的管頭和標本采集器避免受外界污染。帶gDNA Remover逆轉錄試劑哪家劃算
HIV病毒復制的一個重要步驟就是逆轉錄。蘇州cDNA合成逆轉錄制造商
逆轉錄實驗的準備工作：1、實驗器具與材料：（1）移液頭：200ul、10ul；（2）吸頭：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、實驗器具的處理與準備，塑料制品：（包括吸頭、EP管等）將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小頭頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將頭頭放入吸頭臺。3、試劑配制和準備：（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓，后分裝到幾個1。5mlEP管中，-20℃中保存備用。（2）RT中所需要的各種試劑。蘇州cDNA合成逆轉錄制造商