聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現物學和相關科學的許多領域。PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。這種技術被用于生物醫學研究，犯罪取證和分子考古學。通常，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環，每個循環通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應準備：引物內部不應出現互補序列。聚合酶鏈式反應中要確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。武漢實時Real-time PCR供應商

Real-time PCR原理：基于探針的化學法，Real-time PCR應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物；依賴熒光能量共振傳遞（FRET）檢測特異性擴增產物，單單檢測特異性擴增產物，DNA及RNA定量；基因表達驗證；等位基因鑒別；SNP分型；病原體和病毒檢測；多重PCR，探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性；探針可標記不同波長的熒光基團，用于多重PCR反應。對于不同的靶序列需要合成不同的探針，原料成本較高。揚州實時RT-PCR檢測技術聚合酶鏈反應可用于產生突變基因，突變由科學家隨意選擇。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產物特異性的情況；目的基因和內參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應中同時檢測目的基因和內參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。

引物的設計對于這個實驗至關重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規PCR，引物同源性不高，只要兩條產物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。

Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同。普通PCR的實驗目的只是為了獲得目的基因產物，允許有非特異擴增，只要目標條帶清晰明亮，就可以通過切膠回收的方法回收目標條帶，之后進行后續的克隆、測序。但Real-time PCR的目的是為了讓目的基因按照理論值或是按照接近理論值進行擴增，只有這樣的擴增后續由Ct值推算出的起始量模板量才準確，基于此，Real-time PCR對非特異性擴增和引物二聚體的存在有較嚴格的要求。為了很大限度地減少污染的可能性，調查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產品分析預留單獨的房間。廈門分子生物學熒光定量PCR應用

Real-time PCR提高實驗的重復性。武漢實時Real-time PCR供應商

Real-time PCR-傳統定量PCR：1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。武漢實時Real-time PCR供應商

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