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武漢細胞數字PCR服務

來源: 發布時間:2023-03-30

Real-time PCR原理:基于探針的化學法,Real-time PCR應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物;依賴熒光能量共振傳遞(FRET)檢測特異性擴增產物,單單檢測特異性擴增產物,DNA及RNA定量;基因表達驗證;等位基因鑒別;SNP分型;病原體和病毒檢測;多重PCR,探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號,因此減少了背景熒光和假陽性;探針可標記不同波長的熒光基團,用于多重PCR反應。對于不同的靶序列需要合成不同的探針,原料成本較高。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應得到解決。武漢細胞數字PCR服務

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所謂real-timeQ-PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基因,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程,之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術的發展過程中,兩個重要的發現起著關鍵的作用:(1)TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現,它能降解特異性熒光記探針,因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。(2)此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。珠海細胞Real-time PCR原理實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數較敏感、較準確的方法。

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Real-time PCR雙熒光標記探針設計原則:具體的其他要求可以具體聯系設計公司,拿到合成好的引物,需要先確認引物的性能。可以用這對引物先擴增梯度稀釋后的標準品(標準品介紹見后續內容)。由不同梯度標準品的加量和其對應的Ct值,描繪出一條標準曲線。這里要注意根據標準曲線得到的參數是非常重要的。引物性能確認:1.決定系數R2大于0.98,越接近于1,結果越可靠。2.擴增效率一般要求在0.8-1.2,越接近于1,越好。3.檢測的靈敏度,必須確認,通常要求35個循環以內,一般可以得到比較好的定量結果,30個循環以內,沒有非特異性擴增產生。4.NTC是必須要確認的,通常要求30個循環內沒有引物二聚體產生。

聚合酶鏈式反應生物學研究的歷史中占據了重要的地位。以此為基礎發展出包括Real-time PCR在內的多項應用技術。自誕生后Real-time PCR技術持續發展,從簡單的增擴到整個PCR過程,Real-time PCR表現出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環增擴曲線的增長。事實并非如此,早期的軟件不能在運行期間提供可視化的增擴曲線。主要是因為SDS軟件采用整個平臺較終的數據執行數據分析工作,而不是分析每個單獨的反應循環。對某些設備來說,必須向分析軟件提供實時的數據,有些設備則不需要。前一種設備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴曲線,同時顯示在電腦屏幕上。擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段。

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聚合酶鏈式反應準備:PCR引物設計,PCR反應中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準),5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則:引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC很好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。聚合酶鏈式反應準備:引物內部不應出現互補序列。上海骨頭定量PCR應用

PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。武漢細胞數字PCR服務

為了便于對所檢測樣本進行比較,在real-timeQ-PCR反應的指數期,首先需設定一定熒光信號的域值,一般這個域值(threshold)是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號(baseline),熒光域值的缺省設置是3~15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號,它可用于定義樣本的域值循環數(Ct)。Ct值的含義是:每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,因此只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。武漢細胞數字PCR服務

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