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嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)評(píng)估

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-04-11

Cas9蛋白是一種切割外來(lái)DNA的酶,像一把分子剪刀。該蛋白通常與兩個(gè)RNA分子結(jié)合:crRNA和另一個(gè)稱為tracrRNA(或“反式j(luò)ihuocrRNA”)。這兩個(gè)RNA分子引導(dǎo)Cas9到它將進(jìn)行切割的目標(biāo)部位。這段DNA是與crRNA的20個(gè)核苷酸互補(bǔ)的。CRISPR技術(shù)是從細(xì)菌和古細(xì)菌的自然防御機(jī)制中改編而來(lái)的。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白,包括Cas9,來(lái)阻止病毒和其他異物的攻擊。它們主要通過(guò)切碎和破壞外來(lái)入侵者的DNA來(lái)做到這一點(diǎn)。當(dāng)這些組件被轉(zhuǎn)移到其他更復(fù)雜的生物體中時(shí),它允許對(duì)基因進(jìn)行操縱,或“編輯”。挑選前面的潛在脫靶位點(diǎn),通過(guò)PCR測(cè)序驗(yàn)證是否脫靶。嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)評(píng)估

嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)評(píng)估,脫靶檢測(cè)

對(duì)于CAR修飾的免疫細(xì)胞,應(yīng)采用多種體外方法評(píng)估其胞外抗原識(shí)別區(qū)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過(guò)評(píng)估TCR與人體自身抗原肽的交叉識(shí)別能力來(lái)評(píng)估。首先,應(yīng)采用體外試驗(yàn)測(cè)定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA(與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同)復(fù)合物的親和力,并說(shuō)明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外,還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能,應(yīng)確定靶抗原肽的較小識(shí)別基序(motif),并采用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析評(píng)估交叉反應(yīng)性。如果計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)可識(shí)別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽,應(yīng)在體外測(cè)定TCR修飾免疫細(xì)胞對(duì)表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原肽的的細(xì)胞的識(shí)別能力。如果不能排除交叉反應(yīng)性,應(yīng)基于含有潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的蛋白的表達(dá)模式以及TCR與潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的親和力來(lái)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。為獲得TCR與其他等位HLA潛在交叉反應(yīng)性的信息,應(yīng)進(jìn)行充分的HLA交叉反應(yīng)性篩選。武漢高精度脫靶檢測(cè)技術(shù)脫靶(off-target)效應(yīng)是指MicroRNA Agomir/Antagomir可以與特異性互補(bǔ)的核苷酸序列結(jié)合。

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基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外,長(zhǎng)期隨訪中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn),量化評(píng)估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性,或利用在靶活性來(lái)預(yù)測(cè)脫靶活性的水平。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)同時(shí)關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細(xì)胞中整合位點(diǎn)及表達(dá)。評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性,判斷是否需要開(kāi)展另外的遺傳毒性研究,評(píng)估插入突變(插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等)引起的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問(wèn)題;鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。非臨床研究是藥物開(kāi)發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。

使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設(shè)計(jì)核酸酶進(jìn)行基因組編輯,可以將遺傳物質(zhì)定向?qū)氩溉閯?dòng)物基因組的特定位點(diǎn)。然而,可能會(huì)出現(xiàn)非預(yù)期的靶上和靶外基因組修飾,這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定,并破壞正常基因的功能,從而可能導(dǎo)致臨床前和臨床研究中的安全問(wèn)題。基因編輯目前的脫靶分析技術(shù)主要依賴于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)。這些預(yù)測(cè)缺乏可靠性,因?yàn)樗鼈冎缓w了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無(wú)法被全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到。我們是開(kāi)發(fā)用于全基因組靶向/非靶向分析的無(wú)偏分析的先驅(qū)。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評(píng)估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我們的多功能且經(jīng)濟(jì)高效的檢測(cè)方法可檢測(cè)靶向和非靶向基因組改變。我們先進(jìn)的分析技術(shù)與強(qiáng)大的內(nèi)部生物信息學(xué)體系相結(jié)合,可靠地量化了預(yù)期的靶向整合與非預(yù)期結(jié)果(如易位和INDEL)之間的比率。脫靶檢測(cè)服務(wù),推薦唯可生物,實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng),專業(yè)性高,檢測(cè)效率高,結(jié)果準(zhǔn)確率高。

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通常不需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性組合試驗(yàn),但應(yīng)根據(jù)基因zhiliao產(chǎn)品的特點(diǎn)、產(chǎn)品的具體適應(yīng)癥、載體的已有信息、導(dǎo)入基因序列結(jié)構(gòu)等,評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性,判斷是否需要開(kāi)展另外的遺傳毒性研究,如研究基因組修飾的發(fā)生情況,并檢測(cè)隨后可能發(fā)生的異常細(xì)胞行為;評(píng)估插入突變(插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等)引起的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品采用基因編輯或轉(zhuǎn)座子技術(shù)時(shí),需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問(wèn)題;鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。基因編輯脫靶檢測(cè),推薦唯可生物,實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng),專業(yè)性高,檢測(cè)效率高,結(jié)果準(zhǔn)確率高。武漢高精度脫靶檢測(cè)技術(shù)

預(yù)算允許的情況下,通過(guò)全基因組測(cè)序的方法進(jìn)行全基因組序列的分析和比對(duì)更精細(xì),如基于NGS的iGUIDE方法。嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)評(píng)估

gRNA的長(zhǎng)度和錯(cuò)配: 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下,18-20 bp的長(zhǎng)度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針:1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過(guò)3個(gè)錯(cuò)配;2) 在PAM的12 bp內(nèi),應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾:在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦酰基乙酸酯會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾,使脫靶切割減少40-120倍,同時(shí)保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性,降低脫靶效應(yīng)。嘉興基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)評(píng)估

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