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來源: 發布時間:2021-08-28

如何提高細胞轉染效率:1.組織培養試劑優化細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養基和添加劑,并經可能減少所用試劑的變更。基礎培養基—目前所使用的各種市售培養基(如,RPMI 1640和DMEM)。培養基的成分包括營養物質(氨基酸,葡萄糖),維生素,無機鹽,和緩沖物質。有些成分非常不穩定,因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產生問題。務必要使培養基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質,如HEPES,當暴露于光照下就會分解產生細胞毒性物質。另外,血清,添加劑,來自于培養箱內的污染物、化學物質,或/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。2.細胞生長狀態密切觀察您的細胞;確保它們狀態良好。在開始轉染細胞之前,先制定一個適當的種板方案,使細胞密度從轉染開始到結束都保持較佳狀態。增加成功幾率—細胞是轉染過程中的一個關鍵元素,它可以是影響結果的一致性和質量的較重要的變量。一般的瞬時轉染 方法多采用脂質體法。開封正規細胞高效轉染試劑價格

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細胞轉染:(1)轉染試劑的準備A.將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩,。(2)選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉染試劑,再次震蕩。(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。(4)吸去培養板中的培養基,用PBS或者無血清培養基清洗一次。(5)加入混合液,將細胞放回培養箱中培養一個小時。(6)到時后,根據細胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養基繼續培養24-48小時。合肥細胞高效轉染試劑哪里買細胞鋪板密度用于轉染的較佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異。

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轉染的注意事項:用于蛋白生產的細胞的轉染可以在添加有血清或無血清培養基中進行。但更傾向于使用無血清培養基表達蛋白,因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養基一般針對某一特定細胞類型優化并有幾類無血清培養基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養基低得多)。無蛋白培養基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物,限定化學成分的培養基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應用的一種。在含血清時轉染的細胞可以適應無血清培養基,無蛋白培養基或限定化學成分的培養基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S),對于已適應無血清或無蛋白培養基的細胞,可以使用其培養基進行轉染。其他一些無血清培養基包含克制陰離子脂質體介導轉染的成分,在這些情況下,有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養基中進行培養和轉染。

細胞轉染的注意事項:物品(PS)物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉染的培養基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。所以,在轉染培養基中不能使用物品,甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,在轉染前也不必潤洗細胞。對于穩定轉染,不要在選擇性培養基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外,為了保證無血清培養基中細胞的健康生長,使用比含血清培養基更少的物品量。大部分細胞可以在無血清培養基中幾個小時內保持健康。

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細胞轉染方法:1.脂質體轉染法陽離子脂質體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內,形成DNA脂復合物,也能被表面帶負電的細胞膜吸附,再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前實驗室較方便的轉染方法之一,其轉染率較高,優于磷酸鈣法。由于脂質體對細胞有一定的毒性,所以轉染時間一般不超過24小時。常用細胞類型:cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等2.電穿孔轉染法電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內,這種方法就是電穿孔。當遇到某些脂質體轉染效率很低或幾乎無法轉入時建議用電穿孔法轉染。一般情況下,高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現在針對細胞死亡開發出了一種電轉保護劑,可以較大的降低細胞的死亡率,同時提高電穿孔轉染效率。有血清時的轉染 血清一度曾被認為會降低轉染效率。開封正規細胞高效轉染試劑價格

可以使用一些營養豐富的無血清培養基,或者在轉染培養基中使用血清。開封正規細胞高效轉染試劑價格

細胞轉染的注意事項:1.細胞鋪板密度用于轉染的較佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異。因轉染試劑對細胞有毒害作用,細胞太少,容易死。一般轉染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比,在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系,如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子,而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高,因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。開封正規細胞高效轉染試劑價格

與原代細胞相關的擴展資料:

【更多】
原代細胞(primary culture cell)是指從機體取出后立即培養的細胞。有人把培養的第1代細胞與傳10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫學基礎研究,如蛋白質組學、基因組學、細胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學研究等,還可應用于當今熱門的生物醫藥產業如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。原代細胞在生物醫藥領域有不可替代性作用,市場前景廣闊。
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