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合肥太原細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

來源: 發(fā)布時(shí)間:2022-09-10

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞狀態(tài)這點(diǎn)非常重要,不要急于求成,一定要讓細(xì)胞處于較佳的生長(zhǎng)狀態(tài)再做。有文獻(xiàn)說傳代不要超過17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好,不要用傳了很多代的細(xì)胞去做,細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。或者,幾種來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售~通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓。合肥太原細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

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細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟:1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。6.到時(shí)后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)~石家莊細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。

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轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,CAT活性也較高。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明,對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法:1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附,再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前實(shí)驗(yàn)室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性,所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。常用細(xì)胞類型:cos-7、BHK、NIH3T3、Hela等2.電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi),這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下,高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70%的細(xì)胞。現(xiàn)在針對(duì)細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑,可以較大的降低細(xì)胞的死亡率,同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率在現(xiàn)生命可續(xù)研究中,大部分的工作是利用基因功能研究來探索生命過程。

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影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素:1.轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系不匹配轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系也是講究配合默契的,使用同一種試劑,不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同。但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn),通過這些資料可選擇較適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然,較適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。因?yàn)橛行┘?xì)胞系是不穩(wěn)定的,可能隨著培養(yǎng)時(shí)間的改變,培養(yǎng)條件的不同,不同的選擇壓力,可能引起不同的克隆選擇。因此就算是同一個(gè)細(xì)胞系,在不同條件下轉(zhuǎn)染能力的差異可能會(huì)很**部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康。南京正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家便宜

陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑,以其適用宿主范圍廣。合肥太原細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):物品(PS)物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用物品。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性物品的競(jìng)爭(zhēng)性克制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng),使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量合肥太原細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

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