原代細胞的分離與培養：從組織制備原代細胞，即使捱過了極其嚴苛的解離步驟，不嚴謹的分離操作可能會導致細胞生長緩慢、表型不一致甚至細胞污染，特別是由于組織中可能含有細菌等微生物，污染問題對于原代細胞的分離和培養是一個很大的隱患。而為了讓研究人員不再為這些問題頭疼，現在已經出現了一些細胞公司可供應現成的原代細胞，并對應配有充分優化的培養基和實驗方案，這使得原代細胞的培養和研究比以往要輕松得多。而對于具備自主從組織中獲取原代細胞的實驗室，也建議以商業化的原代細胞作為對照，采用均一性和穩定性更好的P2/P3代次進行實驗，并用專門的原代細胞培養基進行培養，較大限度提高原代細胞的生長。具有體內組織特異性特征并且純度高。寧波原代細胞分離試劑盒廠家批發價

原代細胞培養實驗室常規步驟為：1）將動物組織從機體中取出并消毒除去存留在組織上的細菌、細菌、等污染源，這些污染源將會所需培養的原代細胞凋亡、停止生長和繁殖直至死亡，因此整個原代細胞培養過程中較全在無菌狀態下進行。2）將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘，通常在37C水浴里進行，而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細胞的類型，比如成骨、肌肉、心、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個細胞，但是對于腦組織和乳腺等軟組織，就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶，以免損傷分散出來的單個細胞。3）將分散而成的單個細胞置于合適的培養基（含有特殊細胞生長因子、添加劑以及血清，或者無血清培養基）中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，整個過程都是在無菌情況下操作南京原代細胞分離試劑盒廠家現貨以5ml為較低限度，否則攪拌時會產生氣泡對細胞造成傷害。

原代細胞轉染操作步驟（以24孔培養板為例）：A.細胞接種：轉染前現在接種細胞，每孔500μl培養基（不可加物品），使細胞在轉染時密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物準備：1.6pmolsiRNA用50μl無血清培養基稀釋。2.2μlRFectPM用50μl無血清培養基稀釋。輕輕混勻，室溫孵育5min。注意：確保在25min內執行第三步操作，不要過于延遲。3.孵育5min后，將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻，室溫孵育20min。C.將混合物加到培養的細胞內（完全培養基培養）：1.將100μl混合物加入培養孔內，培養孔內含有0.5ml培養的細胞。輕輕晃動培養板，混勻。2.37°C培養18-72h，檢測基因克制效果。如果需要，細胞培養4-6h時可以更換培養基，但不是必須。孵育時間的長短，取決于細胞類型、所干擾基因本身及分析方法。可設置不同的孵育時間進行實驗以確定較佳孵育時間。轉染實驗優化:為了提高轉染效率，較好對轉染條件進行優化，特別是開始使用。

原代細胞體外培養現狀：原代細胞自然生長有兩種方式，錨定依賴或非錨定依賴，這主要取決于它們在體內的組織來源：外周血（非錨定依賴）或固體組織部位（錨定依賴）。原代細胞一旦分離后，24-48h內需要進行貼壁或起始，開始培養。廣義地說，所有的哺乳動物細胞，無論其類型或來源，都需要在與人類生理條件非常相似的條件下生長。此外，它們還需要一個pH可調節的生長環境，并且培養基中需包含細胞類型特定的營養因子、生長因子、葡萄糖和/或物品。為了確定一種特定細胞類型在低至無血清培養基中正常生長和功能所需的較低條件，相關研究工作已經揭示了生長培養基必須包含的基本成分：胰島素、轉鐵蛋白、葡萄糖和各種鹽、維生素和氨基酸1。然而，除此之外培養基也可以含有組織和細胞特異性細胞因子和增殖、生存所需的生長因子。例如，原代內皮細胞和血管平滑肌細胞都需要添加L-谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子（FGF），但是，應該添加額外的組織特異性因子，以防止成纖維細胞的生長。大多數組織可以制備原代細胞，但生長的快慢及難易程度不一。

原代細胞的培養與建系細胞的來源多樣，培養方法也各不相同，凡是來源于胚胎、組織部位及外周血，經特殊分離方法制備而來的原初培養的細胞稱之為原代細胞。原代細胞經分散接種之手段稱為傳代。凡能經傳代方式進行再次培養的細胞稱為傳代細胞。若能穩定生長傳至10~20代以上的細胞可確立為細胞系。若有條件能開展單細胞克隆、純化，經大量擴增后所形成的生物學特性穩定的克隆化細胞群，稱之為細胞株或克隆細胞。此過程稱為細胞的純化或細胞克隆。這些基本技術是從事細胞培養工作的基礎，只有熟悉和掌握了基本技術,才可能更快捷地學習和掌握其他方法,本章重點敘述常用的基本技術。靠前節原代細胞的取材人和動物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，是進行細胞培養的靠前步，若取材不當，將會直接影響細胞的體外培養加入的培養液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來。寧波原代細胞分離試劑盒廠家批發價

取樣后培養時間較少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代。寧波原代細胞分離試劑盒廠家批發價

原代細胞培養問題：1、細胞培養過程中，多久更換一次培養基這取決于細胞生長的速度。一般而言2-3天更換一次培養基，許多細胞培養實驗室通常在周一，周三，周五更換培養基。注意：凍存細胞復蘇后，在6-16小時內更換培養基，以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細胞。2、我能擴增培養和再次凍存原代正常人類細胞嗎？這取決于細胞的類型。一些細胞類型像神經細胞，神經膠質細胞和一些生長緩慢的上皮細胞，不推薦擴增培養和再次凍存。其它的細胞類型像成纖維細胞、星形細胞、腎系膜細胞、星形膠質細胞等等，可以擴增培養和再次凍存。然而，需要注意的是再次凍存的過程可能導致細胞生長性能的改變。3、培養瓶中應該加入多少體積的培養基？我們推薦的用量為：T-25培養瓶5ml，T-75培養瓶15ml，T-150培養瓶30ml。寧波原代細胞分離試劑盒廠家批發價