多光子顯微鏡的前景巨大作為一個多學科交叉、知識密集、資金密集的高技術產業,多光子顯微鏡涉及醫學、生物學、化學、物理學、電子學、工程學等學科,生產工藝相對復雜,進入門檻較高,是衡量一個國家制造業和高科技發展水平的重要標準之一。過去的5年,多光子顯微鏡市場集中,由于投產生產的成本較高,技術難度大,目前涌現的新企業不多。顯微鏡作為一個傳統的高科技行業,其作用至今沒有被其他技術顛覆,只是不斷融合并發展相關技術,在醫療和其他精密檢測領域發揮著更大的作用。顯微鏡的商業化發展已進入成熟期,主要需求來自教學、生命科學的研究及精密檢測等,全球市場呈現平緩的增長態勢。然而,**、、顯微鏡產品(如多光子顯微鏡、電子顯微鏡)正拉動市場需求,多光子顯微鏡市場發展潛力巨大。多光子顯微鏡在基礎科學和臨床診斷領域的應用范圍正在持續增長。美國高速高分辨率多光子顯微鏡技術
與傳統的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,多光子顯微鏡具有光學切片和深層成像等功能,這兩個優勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經的了解與認識。2019年,JeromeLecoq等人從大腦深處的神經元成像、大量神經元成像、高速神經元成像這三個方面論述了相關的MPM技術。想要將神經元活動與復雜行為聯系起來,通常需要對大腦皮質深層的神經元進行成像,這就要求MPM具有深層成像的能力。激發和發射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題,但這會帶來其他問題,例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發光。Ultima Investigator多光子顯微鏡準確定位證實了多光子顯微鏡對皮膚和別的皮膚病的診斷的可行性。
雙光子熒光顯微成像主要有以下優點:a.光損傷小:雙光子熒光顯微以可見光或近紅外光為激發光,對細胞和組織的光損傷小,適合長期研究;b.穿透力強:與紫外光、可見光或近紅外光相比,穿透力強,可用于生物樣品的深入研究;c.高分辨率:由于雙光子吸收截面很小P,熒光只能在焦平面很小的區域激發,雙光子吸收被限制在焦點λ左右的體積內;d.漂白區域很小,焦點外不發生漂白。E.高熒光收集率與共焦成像相比,雙光子成像不需要濾光片,提高了熒光收集率。采集效率的提高直接導致圖像對比度的提高。F.對探測光路要求低。由于激發光和發射熒光的波長差越來越大,加上自發三維濾波效應,多光子顯微鏡對光路采集系統的要求遠低于單光子共焦顯微鏡,光學系統也相對簡單。G.適用于多標簽復合測量許多染料熒光探針的多光子激發光譜比單光子激發光譜更寬,從而可以用單一波長的激發光同時激發多種染料,獲得同一生命現象的不同信息,便于相互比較和補充。
國內顯微鏡制造市場目前斷層嚴重。目前我國顯微鏡行業發展缺乏技術沉淀,20年以上經營積累的企業十分稀缺,深度精密制造、光學主要部件設計及工藝嚴重制約產業升級。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統、蔡司、尼康、奧林巴斯等國外企業。國內具備生產顯微鏡能力的企業屈指可數,若國內顯微鏡企業能打破技術壁壘,切入顯微鏡市場,企業的生產經營將騰躍至一個更高的格局。未來國產多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。目前中國使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統、蔡司、尼康和奧林巴斯壟斷。國內有能力開始生產多光子激光掃描顯微鏡的企業極少,若國內能夠制造出高性能、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡,無異是會面臨極大的市場機遇。多光子顯微鏡之類的先進光學技術能夠在活生物體的大腦表面下更深地成像。
2020年,JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置,稱為FACED(free-spaceangular-chirp-enhanceddelay)。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,會聚角為Δθ。光束進入到一對幾乎平行的高反射鏡中,其間距為S,偏角為α。經過反射鏡多次反射后,激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖(N=Δθ/α),脈沖間以2S/c的時間延遲(c,光速)回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器,通過FACED模塊可產生80個脈沖焦點,其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像,虛擬源越遠,物鏡處的光束尺寸越大,焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm,y軸的橫向分辨率為0.35μm。多光子顯微鏡在臨床前評價IA形態、細胞外基質、細胞密度和血管形成等方面顯示出強大的作用。美國高速高分辨率多光子顯微鏡技術
雙光子共聚焦顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡具有更亮的橫向分辨率和縱向分辨率。美國高速高分辨率多光子顯微鏡技術
隨著現代分子生物學技術的快速發展和科學技術的進步,特別是后基因組時代的到來,人們已經能夠根據需要建立各種細胞模型,這為在體內研究基因表達、分子間相互作用、細胞增殖、細胞信號轉導、誘導分化、細胞凋亡和新生血管生成提供了良好的生物學條件。然而,盡管利用現有的分子生物學方法對基因表達與蛋白質的相互作用進行了深入細致的研究,但仍然無法實現對蛋白質和基因活性的實時動態監測。在細胞的生理過程中,基因尤其是蛋白質的表達、修飾和相互作用往往是可逆的、動態變化的。目前,分子生物學方法無法捕捉到蛋白質和基因的這些變化,但獲得這些信息對于研究基因表達與蛋白質的相互作用非常重要。因此,有必要發展一種動態、實時、連續監測蛋白質和基因活性的方法。美國高速高分辨率多光子顯微鏡技術