微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式,可用于在動物覓食、哺乳、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下,長時程觀察神經突觸、神經元、神經網絡、遠程連接的腦區等多尺度、多層次動態變化。該成果在2016年底美國神經科學年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學專題會議上報告后,得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內的國內外神經科學家的高度贊譽。冷泉港亞洲腦科學專題會議、美國明顯神經科學家加州大學洛杉磯分校的AlcinoJSilva教授在評述中寫道,“從任何一個標準來看,這款顯微鏡都了一項重大技術發明,必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式。它所開啟的大門,甚至超越了神經元和樹突成像。系統神經生物學正在進入一個新的時代,即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結構的復雜生物學事件進行成像觀測。雙光子顯微鏡是結合了雙光子技術和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。國外布魯克雙光子顯微鏡原理
其實電子顯微鏡相比于光學顯微鏡的重要優勢或者存在的比較大意義,準確的來說,不在于放大倍數,而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。通俗的來說,就是進行觀察的時候,除了要將物體放大,還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來。如果兩個相鄰微粒的圖像在光學顯微鏡下,即使放大到很大,看到的可能卻是兩個相交的亮斑(艾里斑),而沒有明顯的界限(更不用說細節了),這表示是分辨率不夠。拋開分辨率談放大倍數是沒有意義的。光學顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,約等于光波波長的一半,通常被說成是光學顯微鏡放大極限,其實準確地來說,應該叫做分辨率的極限。而其產生的原因是光的衍射,根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性,于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能。電子顯微鏡也有多種,題主說的是像REM的。電鏡也存在用衍射規則觀察的,比如低能電子衍射(LEED)和透射電鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體,根據其周期性的特點而生成倒易空間里的衍射圖像,借助elward球或者傅里葉變換就可以轉換到實空間,得到真正的晶體表面圖像了。國內ultima雙光子顯微鏡成像技術雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。
隨著技術的發展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化,結合它的特點,大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面,大致可從兩個方面入手,裝置優化與標本改造。關于裝置優化,我們可以把激光束變得更細,使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關于標本,其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射,解決這個問題,我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡,使其中的物質(主要是脂質)被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解,讓標本的“透明度”得到提高。
第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,其成像視野是該團隊于2017年發布的代微型化顯微鏡的7.8倍,同時具備三維成像能力,獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區域內上千個神經元清晰穩定的動態功能圖像,并且實現了針對同一批神經元長達一個月的追蹤記錄。在一批“早鳥項目”中,該系統已被多個研究組應用于不同的模式動物和行為范式,如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受調控后大腦特定神經元變化、新型神經遞質乙酰膽堿探針的傳導適應性分析以及獼猴三腦區成像等多項研究。雙光子顯微鏡觀察到的現象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發的鈉離子作用電勢。
從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優點:☆穿透能力強:相對于紫外光,可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光,雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內;☆漂白區域小:由于激發只存在于交點處,所以焦點以外的區域都不會發生光漂白現象;☆熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學濾波器(共焦),這樣就提高了對熒光的收集率,而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射。熒光激光雙光子顯微鏡多少錢
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雙光子顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術相結合的新技術。雙光子激發的基本原理是:在光子密度較高的情況下,熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子,經過短暫的所謂激發態壽命后,發射一個波長較短的光子;效果和用波長為長波長一半的光子激發熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優點是具有更深的組織穿透深度,紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區域;因為信號背景比高,所以具有更高的對比度;由于激發體積小,具有定點激發、光毒性小的特點;激發波長由紫外、可見光調整為紅外激發,更加安全。國外布魯克雙光子顯微鏡原理