血清血漿MicroRNA提取:將吸附柱放回收集管內,加500μL洗滌液至吸附柱內,12,000rpm4℃離心1min,棄收集管內廢液。將吸附柱放回收集管內,12,000rpm4℃離心2min,離去殘留的洗滌液。取出吸附柱,放入新的1.5mL離心管內,加入30-50μL洗脫液,靜置3min,12,000rpm4℃離心2min,收集RNA溶液。提取的RNA即可用于下一步實驗或-20℃保存。血清血漿MicroRNA提取的注意事項:裂解液、洗滌液含有刺激性化學物質,操作過程請做好防護措施,避免直接接觸皮膚,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮膚或眼睛,請立即用清水或生理鹽水沖洗,必要時請就醫。消化液、RNACarrier請于-20℃存放,避免反復凍融。DNA提取的質量可以通過測定純度、濃度和完整性來評估。佛山無需氯仿DNA提取
外泌體DNA提取過程:操作步驟:1.請自行準備:無水乙醇、1.5mL離心管。2.取出洗滌液,按以下操作:a)洗滌液A:21mL加入9mL無水乙醇;42mL加入18mL無水乙醇,混勻。b)洗滌液B:9mL加入21mL無水乙醇;18mL加入42mL無水乙醇,混勻。c)配制好的洗滌液如出現沉淀,可在37℃溶解,搖勻后使用。3.取1.5mL離心管,加入200μL外泌體樣本,再加入200μL裂解液及20μL消化液,漩渦震蕩10秒,充分混勻,65℃水浴10分鐘。4.加入0.9mL無水乙醇,輕輕顛倒混勻,如有半透明懸浮物,不影響DNA的提取與后續實驗。高脂肪含量RNA提取可測序RNA提取是分子生物學和遺傳學研究中的重要步驟。
RNA提取和DNA提取實驗中常見問題及過程中的注意事項:降解:降解問題是RNA制備中常常到的問題。因為在RNA提取過程中,樣品儲存不當或裂解效率低等情況都會導致降解。對于DNA提取,降解不是一個大問題,因為對于PCR,DNA可以被剪切并且工作正常,如果不希望有較多剪切的DNA,可以使用弱裂解的方法。PCR清理時的注意事項:PCR凈化其實并不是DNA提取技術本身,但它是一種效率高且簡單的技術,它只是添加高濃度的結合鹽(通常每體積PCR反應3-5體積鹽)和離心來過濾。在實驗過程中,PCRClean-up試劑盒出現故障也會導致整個實驗功虧一簣。因為在PCR反應中有較多吸收260度紫外線的物質,比如:核苷酸、去污劑、鹽和引物。所以,PCR凈化試劑盒經常無法正常工作可能是由于PCR反應失敗所造一般成較難清理。
骨組織RNA提取方法及步驟:適用于快速提取骨組織細胞總RNA,使用獨有基因組DNA清理柱技術可有效清理電泳可見gDNA殘留,RNA可用于反轉錄PCR,熒光定量PCR等。骨組織堅硬、骨細胞密度低、而且外周基質含有大量黏蛋白(蛋白多糖)和RNA難以分離,無法用傳統Trizol法進行高質量提取。本方法采用獨有的不含苯酚/氯仿配方的裂解液,并添加多種成分去除骨組織蛋白多糖。同時獨特基因組DNA清理柱技術可以有效清理gDNA殘留,得到的RNA一般不需要DNase消化,可用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶,離心沉淀去除多糖和次級代謝產物,然后裂解混合物用乙醇調節RNA結合吸附到基因組DNA清理柱,然后RNA被選擇性洗脫濾過,吸附在基因組DNA清理柱上的殘留DNA無法洗脫連同柱子一起丟棄從而清理掉DNA。濾過的RNA用乙醇調節結合條件后,RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜,再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟,去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物,蛋白等雜質去除,較后低鹽的RNasefreeH20將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。DNA提取的步驟包括細胞破碎、DNA分離、純化和洗滌等。
microRNA提取方法及步驟:室溫放置5分鐘以充分分離核酸蛋白復合物。加入200μl氯仿,劇烈振蕩15秒。室溫放置2-3分鐘,13,000rpm離心10分鐘。小心取上清(約600μl)轉入到新的離心管,加入1.5倍體積的無水乙醇(必須是室溫的,通常900μl),渦旋混勻。此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心,立刻接下步。將混合物(每次小于700μl,多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)12,000rpm離心30-60秒,棄掉廢液。加700μlWashSolution1(請先檢查是否已加入無水乙醇!),12,000rpm離心30秒,棄掉廢液。加入500μlWashSolution2/3(請先檢查是否已加入無水乙醇!),12,000rpm離心30秒,棄掉廢液。加入500μlWashSolution2/3,重復一遍。RNA提取可以使用不同的組織或細胞類型來比較RNA的表達。南京腦脊液DNA提取企業
DNA提取的原則,核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。佛山無需氯仿DNA提取
DNA提取的一些問題,提取的細菌基因組DNA有降解,為什么?確認選用的培養菌體是否新鮮,如果菌體需要保存時,請于-80℃保存。起始菌液量過多,導致菌液裂解不充分,部分DNA降解。菌體本身富含DNA酶活性,加入Digestionsolution后再加20uL0.5MEDTA溶液來抑制內源性核酸酶。提取的基因組DNA生物活性差,為什么?提取的基因組DNA中鹽分濃度過高,請嚴格按照說明書操作。提取的基因組DNA中含有乙醇。離心的速度和時間應該嚴格遵循說明書要求進行。佛山無需氯仿DNA提取
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