核酸提取,是分子生物學中較常見的基本操作,一般分為DNA提取與RNA提取,提取核酸的質量直接影響后續的檢測工作,暫對常見的問題進行了一個總結。DNA提取:1.A260/280比值較低?或者A260/280比值較高?用水作為洗脫液比較偏低,或者蛋白質殘留,但如果操作過程中使用了苯酚,則更可能是苯酚殘留。而比較高可能是大量RNA殘留,沒有使用RNaseA,或RNaseA活性下降。A260值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差則為苯酚殘留。DNA提取的成功率受到多種因素的影響,如樣品來源、存儲條件等。天津尿液DNA提取費用
磁珠法提取DNA提取的優勢,磁珠法是納米科技與生物技術的完美結合,具有其他DNA提取方法無法比擬的優勢,主要體現在:1、能夠實現自動化、高通量操作,配合96孔的核酸自動提取儀,在以往做一個樣品的提取時間內可同時實現對96個樣品的處理,效率直接提高96倍,滿足了當前生物學高通量操作的要求,使得在大規模戴口罩爆發時能夠進行快速篩查原因,這個優點是其他方法難以趕超的。2、操作簡單、用時短,整個提取流程只有裂解、結合、洗滌、洗脫四步短時間內即可完成。3、安全無毒,不使用傳統方法中的苯、氯仿等有毒試劑,對實驗操作人員的傷害少,保護了實驗人員的身體健康。4、磁珠與核酸的特異性結合使得提取的核酸純度高、濃度大。5、靈敏度高,適合法醫樣本等痕量DNA提取。蘇州外泌體DNA提取可測序DNA提取需要通過添加蛋白酶消化蛋白質。
DNA提取的幾種方法介紹,濃鹽法:利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同,將二者分離,常用的方法是用1M氯納提取化鈉抽提,得到的DNP黏液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間,而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來。也可用0.15MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白。兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些。
血漿DNA與血漿游離DNA提取試劑的選擇方法:血漿DNA,又稱血液循環DNA、游離DNA,是指血液中游離于細胞外的DNA,其來源主要有三:白細胞崩解釋放的DNA、壞死組織特別是腫組織釋放入血液的DNA和染上病毒、細菌的DNA。近幾年來,隨著基因診斷技術的發展,游離DNA的應用價值越來越大,如優生篩查、腫早期診斷、遺傳病檢測和病原體染上基因檢測等。但血液中游離DNA含量一般較低,片段較小,不易提取,這很大程度影響了游離核酸的基因檢測和各種研究的開展。DNA提取的原則,核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。
RNA提取一般在pH值低于7時進行。在堿性pH值下,由于核糖的2'位置存在OH基團,RNA更容易被堿性水解降解。此外,RNA在酸性pH值下傾向于保留在水相中。外泌體DNA提取注意事項:1.實驗過程中較好戴一次性干凈手套、口罩,使用超純水。2.如樣本量不足200μL,請用0.85%生理鹽水補至200μL。RNA提取中常見的問題之RNA中有基因組DNA污染:材料中核酸含量高:脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高,可進行多次酚/氯仿抽。提以去除多余的DNA。也可以在提取后加入DNaseI處理,降解DNA。材料過量:增加試劑用量。RNA提取可以用于研究RNA的降解和穩定性。蘇州外泌體DNA提取可測序
RNA提取可以使用不同的組織或細胞類型來比較RNA的表達。天津尿液DNA提取費用
DNA提取鑒定方法:分光光度法:在260nm和280nm處測定DNA溶液的光吸收,A260與A280之比應在1.75-1.80之間。低于此值表明制備物中殘留蛋白質成分較高或含有酚,高于此值表明有RNA的殘留。凝膠電泳分析:影響瓊脂糖凝膠電泳DNA遷移率的因素:①DNA分子大小,DNA分子越大遷移速度越慢。②遷移率與瓊脂糖濃度成反比。③DNA構象:a.相同分子量的超螺旋環狀(Ⅰ型),切口環狀(Ⅱ型),線狀(Ⅲ型)DNA,以不同速率通過凝膠。b.一般情況下,遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④電壓:遷移率與所加電壓成正比,但是電壓過大有效分離范圍減小。⑤電場方向:單一方向速率均等,改變方向,極大分子DNA遷移更慢。通過脈沖電場凝膠電泳分離極大DNA。天津尿液DNA提取費用
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