逆轉錄的端粒復制:對于線性基因組,其滯后鏈的末端是無法完整復制的,每次約損失30-200個核苷酸(Cells.2020Feb22;9(2).)。這樣隨著細胞分裂,端粒會持續縮短,造成復制性衰老。對于大多數體細胞來說,端粒磨損是一種控制其分裂潛力的機制,但對于需要多次增殖的干細胞來說,必須設法維持端粒長度。端粒酶(telomerase)可以通過逆轉錄過程延長端粒。端粒酶由端粒酶RNA(TERC)和端粒酶逆轉錄酶(TERT)組成。TERT使用TERC作為模板,在染色體的單鏈末端合成端粒DNA的重復序列。大多數體細胞缺乏端粒酶活性,因而容易衰老。但未分化的生殖細胞,干細胞,活化的淋巴細胞和大多數疙瘩細胞具有高水平的端粒酶活性,可以克服端粒磨損并維持無限的細胞分裂。高效的逆轉錄體系可提高反應效率和檢測靈敏度。成都彩色反轉錄制造商
反轉錄酶(reversetranscriptase,也可寫成逆轉錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致死RNA病毒中發現了一種特殊的DNA聚合酶,該酶以RNA為模板,以dNTP為底物,tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物,在tRNA3'-OH末端上,根據堿基配對的原則,按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈,這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA,CDNA)。反轉錄酶(Reversetranscriptase)是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA(cDNA)的酶。哺乳類C型病毒的反轉錄酶和鼠類B型病毒的反轉錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉錄酶則由兩上亞基結構。真核生物中也都分離出具有不同結構的反轉錄酶。成都莖環法逆轉錄酶生產廠家逆轉錄實驗前要對反應體系進行無RNA和無反轉錄酶的對照。
逆轉錄實驗的準備工作:1、實驗器具與材料:(1)移液頭:200ul、10ul;(2)吸頭:200ul、20ul;(3)EP管1。5ml、100ul;(4)水浴箱。2、實驗器具的處理與準備,塑料制品:(包括吸頭、EP管等)將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中(必要時小頭頭需要用吸管打入DEPC水)37℃過夜,然后送至高壓3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小時左右烘干),試驗前將頭頭放入吸頭臺。3、試劑配制和準備:(1)DEPC水:泡實驗器具的DEPC水的配制:1000ml雙蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉錄中所用的DEPC水的配制:100ml鹽水瓶內裝40ml雙蒸水,加40ulDEPC,37℃過夜,送至高壓,后分裝到幾個1。5mlEP管中,-20℃中保存備用。(2)RT中所需要的各種試劑。
逆轉錄試劑是一類普遍應用于生物學和醫學研究的試劑,它們可以用于逆轉錄反應的實驗操作。逆轉錄反應是將RNA轉錄成DNA的過程,與正常的DNA轉錄成RNA的過程相反。逆轉錄試劑可以促進這個過程的進行,從而使得研究人員能夠更好地了解RNA的結構和功能。逆轉錄試劑通常由逆轉錄酶、緩沖液和酶的輔助因子組成。逆轉錄酶是一種酶類蛋白質,它可以在逆轉錄反應中起到關鍵的作用。緩沖液的主要作用是維持反應體系的PH值和離子強度,從而保證逆轉錄反應的順利進行。酶的輔助因子(如酶抑制劑)則可以幫助研究人員減少誤差和提高實驗的可重復性。逆轉錄實驗過程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉錄酶的選擇。
反轉錄酶的用處:由它催化轉錄合成的DNA稱為互補DNA(cDNA)。通常情況下,細胞內的轉錄應由DNA到RNA的,所得RNA為信使RNA(mRNA)供蛋白質合成作模板用。而在部分RNA病毒中,要實現自身擴增,必須具有DNA,因此先由RNA逆轉錄合成cDNA再由cDNA轉錄出RNA。逆轉錄酶可用RT—PCR,將RNA轉變為DNA后擴增,以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發現了反轉錄酶,并認為此酶與病毒的致死性質有關。反轉錄酶也分布于某些正常細胞和胚胎細胞。反轉錄酶的發現表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質非常化,遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究,已成為研究這些學科的有力工具。酵母菌逆轉錄酶是逆轉錄酶家族中的一個重要表示。成都一體化反轉錄試劑研發
逆轉錄PCR在檢測病毒、診斷疾病等方面有普遍應用。成都彩色反轉錄制造商
反轉錄酶的選擇:反轉錄酶(Reversetranscriptase)又稱逆轉錄酶。是以RNA為模板指導dNTP合成互補DNA(cDNA)的酶。一部分反轉錄酶具有RNA酶活性,能夠在轉錄后降解RNA-DNA雜交鏈中的RNA鏈。如果反轉錄酶沒有Rnase酶活性,可加入RNaseH來獲得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶和禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶。依據RT-PCR,理想的狀態下是選擇具有較高熱穩定性的反轉錄酶,cDNA的合成才能在較高的溫度下進行,確保成功轉錄具有較高二級結構的RNA,并確保在整個反應過程中的全部活性,從而得到質量更高的cDNA。成都彩色反轉錄制造商
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